癌癥中的cfDNA羥甲基化檢測(cè)方法及臨床應(yīng)用
在精準(zhǔn)腫瘤學(xué)時(shí)代，異常的遺傳和表觀遺傳學(xué)變化鑒定促進(jìn)了癌癥診斷、管理和治療方式的改變。DNA羥甲基化（5-羥甲基胞嘧啶，5hmC）是一種新興的表觀遺傳修飾，由TET酶通過(guò)氧化5-甲基胞嘧啶（5mC）形成。DNA羥甲基化表現(xiàn)出組織和癌癥特異性模式，在DNA去甲基化和基因調(diào)控中至關(guān)重要。5hmC檢測(cè)方法的最新進(jìn)展，以及在游離細(xì)胞DNA（Cell-Free DNA，cfDNA）中鑒定5hmC，表明了游離細(xì)胞5hmC作為癌癥生物標(biāo)志物的潛力。本文探討了DNA（尤其是cfDNA）羥甲基化在癌癥中的當(dāng)前和新興技術(shù)及應(yīng)用。
5hmC是一種在正常發(fā)育和基因調(diào)控等生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用的表觀遺傳修飾。5hmC失調(diào)會(huì)介導(dǎo)各種疾�。ㄈ绨┌Y）發(fā)展，這表明了其生物學(xué)過(guò)程中重要作用。液體活檢為獲得基因組和表觀基因組數(shù)據(jù)提供了無(wú)創(chuàng)方法，徹底改變了癌癥的篩查和治療方式。通過(guò)研究來(lái)自血漿等體液中的cfDNA，特別是循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumour DNA，ctDNA）為捕捉腫瘤的異質(zhì)性、監(jiān)測(cè)遺傳和表觀遺傳動(dòng)態(tài)以及檢測(cè)癌癥或復(fù)發(fā)的早期跡象提供了機(jī)會(huì)。以下內(nèi)容從DNA羥甲基化的生物學(xué)角色和機(jī)制進(jìn)行概述，并為DNA羥甲基化作為癌癥生物標(biāo)志物的最新進(jìn)展介紹了更新視角。最后討論了在5hmC研究中使用cfDNA和綜合多組學(xué)分析，并討論其在臨床應(yīng)用中的機(jī)遇和挑戰(zhàn)。
DNA羥甲基化的生物學(xué)功能和機(jī)制
DNA去甲基化通路中的羥甲基化
DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是哺乳動(dòng)物DNA中研究最為深入的表觀遺傳標(biāo)記，對(duì)基因調(diào)控至關(guān)重要。5mC可以通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）從S-腺苷甲硫氨酸（SAM）向胞嘧啶的5位共價(jià)轉(zhuǎn)移甲基基團(tuán)來(lái)酶促產(chǎn)生。在主動(dòng)去甲基化通路中，DNA 5hmC通過(guò)TET雙加氧酶（例如TET1、TET2和TET3）氧化5mC產(chǎn)生（圖1）。這一反應(yīng)需要α-酮戊二酸（α-KG）和氧氣，在鐵和抗壞血酸（維生素C）下產(chǎn)生5hmC、琥珀酸和二氧化碳。TET酶進(jìn)一步氧化5hmC產(chǎn)生5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），盡管這些中間體的存在于5hmC的頻率要低得多。與5hmC不同，5fC和5caC不穩(wěn)定，分別被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）和基礎(chǔ)切除修復(fù)（BER）機(jī)制切除和修復(fù)，恢復(fù)為未修飾的胞嘧啶形式。5hmC也可以通過(guò)激活誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶（AID）/載脂蛋白B mRNA編輯酶，催化多肽類（APOBEC）脫氨成5-羥甲基尿嘧啶（5mU），然后通過(guò)BER去甲基化。通過(guò)復(fù)制稀釋也可以發(fā)生胞嘧啶修飾的被動(dòng)去甲基化。
與5mC、5fC和5caC相比，TET酶和TDG-BER耦聯(lián)機(jī)制對(duì)5hmC的親和力較低，表明5hmC是穩(wěn)定的，并不容易去甲基化。此外，5hmC可以在多次細(xì)胞分裂中持續(xù)存在，表明它可能在去甲基化通路之外具有重要的生物學(xué)功能。
DNA 羥甲基化的生物學(xué)功能和分布
5hmC在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞多能性、T淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞）的缺失和分化、以及不同疾病的病因?qū)W等多種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并在活躍的基因調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。5hmC主要在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域中富集，如基因體、增強(qiáng)子以及啟動(dòng)子周圍（圖2）。富含5hmC區(qū)域通常位于活躍的組蛋白修飾（例如H3K4me2和H3K4me3）和組蛋白標(biāo)記的增強(qiáng)子（例如H3K4me1和H3K27ac）附近，表明它可能參與調(diào)節(jié)活躍的基因表達(dá)（圖2）。許多研究表明5hmC水平與基因表達(dá)之間存在正相關(guān)。
圖2：全基因組和位點(diǎn)特異性DNA羥甲基化模式。
盡管全基因組5hmC水平較低，但其在不同細(xì)胞類型、組織和疾病狀態(tài)下的分布差異很大。一般來(lái)說(shuō)，5hmC在腦組織（約占所有胞嘧啶的0.67%）和胚胎干細(xì)胞中最普遍。5hmC豐度似乎與細(xì)胞增殖呈負(fù)相關(guān)，后有絲分裂細(xì)胞通常具有較高的5hmC水平。由于這些細(xì)胞往往具有高度的增殖性，導(dǎo)致在細(xì)胞系和腫瘤組織中檢測(cè)到的5hmC水平較低。
游離DNA和羥甲基化組
對(duì)游離細(xì)胞羥甲基化的研究開啟于2017年，song等人開發(fā)了一種高度敏感的化學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法，能夠檢測(cè)到少量cfDNA輸入中的低水平5hmC。從那時(shí)起開始在各種臨床應(yīng)用中被研究，包括早期癌癥檢測(cè)和預(yù)測(cè)癌癥結(jié)果。盡管與組織相比，cfDNA中的5hmC水平通常較低，但先前的研究表明cfDNA 5hmC模式和動(dòng)態(tài)反映了組織中發(fā)生變化。此外，由于5hmC相對(duì)穩(wěn)定，基因組DNA上的5hmC標(biāo)記可以在cfDNA片段中重現(xiàn)，表明它有潛力作為一種微創(chuàng)的癌癥生物標(biāo)志物。
癌癥中的DNA羥甲基化模式
DNA羥甲基化模式可以在全局（全基因組）或局部（位點(diǎn)特異性基因組，圖2）范圍內(nèi)進(jìn)行評(píng)估。在各種類型的癌癥中，包括膀胱、腦部、胰腺和乳腺癌，都檢測(cè)到全基因組5hmC丟失。在某些情況下，5hmC水平更大降低與更侵襲性腫瘤和更差預(yù)后相關(guān)。在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）細(xì)胞系中，Qiu等人（2018年）觀察到隨著腫瘤侵襲性增加，5hmC逐漸丟失，其中大細(xì)胞轉(zhuǎn)化的CTCL細(xì)胞系顯示出最大的5hmC百分比降低，其次是未轉(zhuǎn)化的CTCL和前CTCL斑塊和補(bǔ)丁。同樣，Song等人（2017年）發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，cfDNA中的5hmC呈現(xiàn)階段依賴性缺失，其中轉(zhuǎn)移性NSCLC顯示出與非轉(zhuǎn)移性NSCLC和健康個(gè)體相比，歸一化羥甲基化區(qū)域的最低水平。但這些發(fā)現(xiàn)可能因所研究的組織類型和人群而異。例如，與Song等人（2017年）的研究不同，其他在中國(guó)人群中進(jìn)行的NSCLC研究報(bào)告稱，與健康對(duì)照組相比，癌癥中的5hmC水平全基因組增加。盡管如此，整體5hmC模式在癌癥和非癌癥對(duì)照之間顯示出不同的特征。
癌癥中也在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域描述了特定基因位點(diǎn)的5hmC增加。在結(jié)直腸癌的cfDNA研究中，Li等人（2017年）報(bào)告了5hmC在基因體、開放染色質(zhì)區(qū)域（DNaseI高敏感位點(diǎn)）以及帶有活躍組蛋白修飾（H3K27ac,H3K4me1,H3K9me1）的區(qū)域富集。在另一項(xiàng)研究中，Sjöstrom等人（2022年）揭示了前列腺癌驅(qū)動(dòng)基因的增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的局部5hmC富集，尤其是雄激素受體（AR）和叉頭盒蛋白A1（FOXA1），與其基因表達(dá)相關(guān)。表明5hmC失調(diào)可能導(dǎo)致疾病狀態(tài)，即使在驅(qū)動(dòng)基因上沒有遺傳突變。
總的來(lái)說(shuō)，這些研究表明整體和局部5hmC模式是強(qiáng)大的標(biāo)記物，能夠區(qū)分癌癥和非癌癥樣本，暗示了5hmC作為癌癥生物標(biāo)志物的潛力，盡管還需要進(jìn)一步研究。
羥甲基化檢測(cè)方法的演變
在過(guò)去十年中，對(duì)羥甲基化組的定量和分析取得了顯著進(jìn)展。早期5hmC分析研究主要通過(guò)質(zhì)譜、薄層色譜、高效液相色譜（HPLC）、免疫檢測(cè)和光譜技術(shù)等定量方法。雖然這些方法能夠準(zhǔn)確定量5hmC水平，但其樣本制備復(fù)雜性、高昂的設(shè)備和試劑成本以及低分辨率使得它們?cè)谂R床環(huán)境中難以實(shí)施。自那以后，科學(xué)家們開發(fā)出了基于測(cè)序的方法，用于全基因組和單堿基分辨率的分析。表1總結(jié)了最常見的5hmC分析技術(shù)。
亞硫酸鹽測(cè)序方法
亞硫酸鹽測(cè)序（BS-seq）是DNA甲基化分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法，能夠提供全基因組范圍內(nèi)的單堿基分辨率評(píng)估。傳統(tǒng)的BS-seq用亞硫酸鈉處理DNA，將未修飾的胞嘧啶（C）、5fC和5caC脫氨基成尿嘧啶（U），并將5hmC轉(zhuǎn)化為胞嘧啶-5-甲磺酸（CMS），而5mC保持不變。由于5mC和CMS的最終讀數(shù)（readout）都是胞嘧啶，BS-seq的一個(gè)限制是無(wú)法區(qū)分5mC和5hmC。為了克服這一障礙，可以在亞硫酸鹽處理前添加化學(xué)物質(zhì)來(lái)保護(hù)或修飾堿基，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基化狀態(tài)的更精確區(qū)分。 氧化亞硫酸鹽測(cè)序（OxBS-seq）和TET輔助亞硫酸鹽測(cè)序（TAB-seq）是改良亞硫酸鹽技術(shù)的示例。OxBS-seq利用高碘酸鉀（KRuO4）將5hmC氧化成5fC。由于5fC是一種不穩(wěn)定的中間體，TDG和BER機(jī)制會(huì)將其再轉(zhuǎn)化為胞嘧啶，使其在亞硫酸鹽處理下發(fā)生脫氨基。與傳統(tǒng)亞硫酸鹽測(cè)序讀數(shù)比較，可以識(shí)別5hmC（BS-seq中的“C”和OxBS-seq中的“T”）。TAB-seq依賴于T4噬菌體β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（T4-βGT）將葡萄糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到5hmC上，保護(hù)其不受TET1氧化。經(jīng)過(guò)氧化和亞硫酸鹽處理后，最終讀數(shù)（readout）允許直接識(shí)別5hmC（5hmC讀作“C”，而胞嘧啶、5mC和其他氧化衍生物讀作“T”）。
酶促和親和方法
為了克服基于亞硫酸鹽方法的局限性，非亞硫酸鹽技術(shù)使用化學(xué)物質(zhì)、酶和抗體來(lái)葡萄糖基化、脫氨基、氧化或選擇性地拉下5hmC，以捕獲其全基因組分布。這些策略反過(guò)來(lái)提高了5hmC分析技術(shù)的靈敏度、特異性和可行性，為臨床應(yīng)用的過(guò)渡提供了便利。
5hmC選擇性化學(xué)標(biāo)記（HMe-SEAL）是另一種基于葡萄糖基化的技術(shù)，它利用T4-βGT將修飾的疊氮葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到5hmC上。隨后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)添加生物素標(biāo)簽，以及隨后的鏈霉親和素珠子拉下生物素化片段。目前，HMe-SEAL優(yōu)化版本廣泛用于稀有細(xì)胞群體（Nano-hmC-Seal）和游離細(xì)胞DNA的5hmC分析。然而，像其他富集技術(shù)一樣，HMe-SEAL無(wú)法對(duì)5hmC位點(diǎn)進(jìn)行單堿基分辨率分析，限制其定量5hmC水平。盡管如此，HMe-SEAL為cfDNA研究提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，因?yàn)樗枰腄NA起始量低，并且可以有效地富集含有5hmC的片段，從而實(shí)現(xiàn)更具成本效益的測(cè)序。
同樣，J結(jié)合蛋白1測(cè)序（JBP1-seq）也依賴于T4-βGT來(lái)葡萄糖基化5hmC。J結(jié)合蛋白1是葡萄糖基化5hmC的天然抗體。在一項(xiàng)比較JBP1-seq與HMe-SEAL和其他基于親和性的5hmC分析方法的研究中，JBP1-seq顯示出顯著不同的5hmC譜圖，并且無(wú)法將染色質(zhì)狀態(tài)與5hmC模式相關(guān)聯(lián)。此外，它可能偏向于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，導(dǎo)致5hmC的富集度降低。然而，優(yōu)化的JBP1-seq工作流程已經(jīng)展示了改進(jìn)的5hmC富集能力，更快的性能（4.5小時(shí)）和降低的DNA起始量要求。需要進(jìn)一步驗(yàn)證以全面評(píng)估這種優(yōu)化工作流程的性能。
其他葡萄糖基化方法包括Jump-seq和5hmC連接寡核苷酸引導(dǎo)測(cè)序（hmTOP-seq）。Jump-seq和hmTOP-seq都使用T4-βGT將疊氮葡萄糖附著在5hmC上，然后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)標(biāo)記帶有發(fā)夾或連接的寡核苷酸，并延伸引物以定位5hmC。最近，hmTOP-seq也被用于檢測(cè)cfDNA中的5hmC。盡管研究圍繞母血cfDNA的產(chǎn)前檢測(cè)展開，hmTOP-seq在極低測(cè)序深度下檢測(cè)胎兒唐氏綜合癥的準(zhǔn)確性達(dá)到了100%。表明它有潛力成為分析游離細(xì)胞羥甲基化組的工具。然而，需要注意的是，Jump-seq和hmTOP-seq都依賴于間接方法來(lái)定量5hmC，可能會(huì)在測(cè)序后引入偏差和假象。此外，Jump-seq往往對(duì)高CpG密度區(qū)域有偏倚，如果5hmC峰太接近可能會(huì)表現(xiàn)不佳。
② DNA脫氨方法
AID/APOBEC酶是一種替代的DNA脫氨方法，無(wú)需亞硫酸鹽處理過(guò)程中產(chǎn)生的不穩(wěn)定的磺化中間體。這一反應(yīng)使用鋅輔因子來(lái)脫氨基單鏈DNA上的胞嘧啶。第一個(gè)采用這種策略的技術(shù)是APOBEC偶聯(lián)表觀遺傳測(cè)序（ACE-seq）。在ACE-seq中，5hmC首先通過(guò)T4-βGT葡萄糖基化以保護(hù)其不受隨后APOBEC3A脫氨基的影響。另一方面，5mC和其他未修飾的胞嘧啶將在APOBEC3A處理下被脫氨基。ACE-seq的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是，ACE-seq可以實(shí)現(xiàn)5hmC的單堿基分辨率比對(duì)，所需的DNA 起始量比BS-seq少1000倍。酶促甲基測(cè)序（EM-seq）遵循與ACE-seq相同的工作流程，但在葡萄糖基化之前使用TET2氧化5mC和5hmC。
單步脫氨基測(cè)序（SSD-seq）是另一種脫氨基技術(shù)，它利用特別設(shè)計(jì)的蛋白eA3A-v10來(lái)脫氨基胞嘧啶和5mC，但不脫氨基5hmC。這種方法消除了脫氨基前額外的葡萄糖基化或氧化步驟的需要。此外，eA3A-v10的脫氨基使用溫和的脫氨基反應(yīng)，克服了亞硫酸鹽處理對(duì)DNA損傷的限制。像ACE-seq一樣，需要注意的是5hmC的reads可能包括5fC和5caC的痕跡，這可能會(huì)高估5hmC水平。然而，由于它們的普遍性和穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于5hmC，可能不會(huì)對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。
新的脫氨基方法將脫氨基與現(xiàn)有的分析技術(shù)相結(jié)合，以提高全基因組5hmC檢測(cè)的分辨率。DNA免疫沉淀偶聯(lián)化學(xué)修飾輔助亞硫酸鹽測(cè)序（DIP-CAB-seq）是一種三步策略：（1）葡萄糖基化、點(diǎn)擊化學(xué)和生物素-鏈霉親和素互作，如HMe-SEAL，（2）APOBEC脫氨基，以及（3）單鏈測(cè)序。盡管DIP-CAB-Seq工作量大，但它展示了與HMe-SEAL相當(dāng)?shù)?hmC富集能力，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了改進(jìn)的單堿基分辨率檢測(cè)。同樣，基于富集的單堿基分辨率5hmC測(cè)序（EBS-seq）遵循類似的工作流程，其中APOBEC脫氨基發(fā)生在鏈霉親和素珠子拉下之前。即使在5hmC含量低的樣本中，如人類癌細(xì)胞系和組織，也能有效地檢測(cè)到5hmC。
④ 基于抗體方法
特異性靶向5hmC或其衍生物的抗體也可以用來(lái)捕獲羥甲基化DNA片段。羥甲基化DNA免疫沉淀（hmeDIP）利用單克隆抗5hmC抗體來(lái)捕獲和拉下羥甲基化DNA，已廣泛用于癌癥組織和細(xì)胞系中5hmC的局部和全基因組分析。盡管基于抗體的分析技術(shù)受到抗體結(jié)合效率的變異性限制，可能偏向于高羥甲基化區(qū)域，但它們具有成本效益、易于實(shí)施，并且可以對(duì)5hmC具有高度特異性。
DNA羥甲基化及其臨床應(yīng)用
5hmC作為一種有前途的癌癥生物標(biāo)志物，展現(xiàn)出獨(dú)特的全局和局部模式，能夠區(qū)分癌癥和非癌癥樣本。以往的研究已經(jīng)探索了它作為癌癥的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的潛力，強(qiáng)調(diào)了它在癌癥管理中的實(shí)用性。圖3和表2突出了5hmC作為癌癥生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用示例。
圖3：DNA羥甲基化在癌癥中的臨床應(yīng)用。
表2：DNA羥甲基化作為癌癥生物標(biāo)志物示例。
DNA羥甲基化作為癌癥檢測(cè)的生物標(biāo)志物
早期發(fā)現(xiàn)癌癥可以使得治療更加有效，預(yù)后更好，因此擁有可靠的診斷生物標(biāo)志物至關(guān)重要。然而，由于早期腫瘤含量極低，尤其是循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA），這使得檢測(cè)變得具有挑戰(zhàn)性。整體和特定基因位點(diǎn)的5hmC模式是很有前景的診斷生物標(biāo)志物。
在一項(xiàng)泛癌研究中，Shao等人（2022年）利用健康個(gè)體和患有膀胱、乳腺、結(jié)直腸、腎臟、肺或前列腺癌患者的cfDNA建立了一個(gè)24個(gè)5hmC基因模型。他們的模型在驗(yàn)證隊(duì)列中成功地區(qū)分了癌癥和健康個(gè)體（AUC=91%，靈敏度=68.6%，特異性=96.6%）。當(dāng)單獨(dú)考慮每種癌癥時(shí)，他們的癌癥特異性加權(quán)診斷（wd）模型實(shí)現(xiàn)了從94%到99.8%的AUC，靈敏度從80%到96%，特異性從96%到100%。對(duì)于早期疾病的檢測(cè)性能也很高，泛癌靈敏度在71.4%和81.3%之間，癌癥特異性標(biāo)志物在I期和II期疾病中分別為89.3%和94.1%。
在一項(xiàng)多中心研究METHOD-2（NCT03676075）中，Chang等人（2024年）還開發(fā)了一個(gè)能夠區(qū)分I-III期結(jié)直腸癌患者和非癌癥對(duì)照的cfDNA 5hmC分類器。他們基于96個(gè)5hmC基因體的模型在內(nèi)部驗(yàn)證中實(shí)現(xiàn)了94.3%的AUC，在外部驗(yàn)證中實(shí)現(xiàn)了90.7%的AUC。他們的cfDNA 5hmC基礎(chǔ)分類器的性能超過(guò)了經(jīng)典的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物癌胚抗原（CEA），后者在內(nèi)部和外部驗(yàn)證隊(duì)列中的AUC分別為77.1%和73.2%。在90%的特異性下，基于5hmC的評(píng)分在I期和II/III期結(jié)直腸癌中的靈敏度為73.5%和85.3%，而CEA在同一階段的靈敏度分別為29.4%和47.2%。在肝細(xì)胞癌、肺癌和結(jié)直腸癌的研究也表明，基于5hmC的模型可以超越傳統(tǒng)的診斷生物標(biāo)志物，突顯了5hmC在癌癥檢測(cè)中的潛力。
盡管全局和基因特異性的cfDNA 5hmC模式作為癌癥的診斷生物標(biāo)志物具有潛力，甚至是對(duì)于早期疾病，但在這些模型可以轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐之前，仍有幾個(gè)問(wèn)題需要解決。首先，當(dāng)前的診斷模型往往只關(guān)注基因特異性的5hmC標(biāo)記，而其他富含5hmC的調(diào)控因子，如增強(qiáng)子，往往被忽視。將其他調(diào)控因子納入這些模型可以提高性能并改善我們對(duì)觀察到的5hmC模式背后的生物學(xué)的理解。其次，未來(lái)的研究應(yīng)該優(yōu)先驗(yàn)證現(xiàn)有的基因標(biāo)記模型，特別是在不同的地理和種族群體中，以評(píng)估這些模型的普適性。
DNA羥甲基化在癌癥中的預(yù)后價(jià)值
除了早期檢測(cè)，有證據(jù)支持5hmC分析在癌癥預(yù)后中的價(jià)值。例如，在肝內(nèi)膽管癌（ICC）中，Dong等人（2015年）表明，與高/陽(yáng)性5hmC水平相比，組織中低或陰性5hmC水平與更高的腫瘤階段、更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更短的總生存期和更差的無(wú)病生存期相關(guān)。同樣，Kuang等人（2024年）揭示了TET2/5hmC子宮內(nèi)膜腺癌與其他TET2和5hmC表達(dá)組合相比，與最差的總生存期相關(guān)（p<0.001）。相比之下，TET2/5hmC子宮內(nèi)膜癌與分化良好的細(xì)胞、最小的肌層侵襲、陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較低的腫瘤階段顯著相關(guān)。多變量分析進(jìn)一步表明，TET2/5hmC關(guān)系可以作為子宮內(nèi)膜癌的獨(dú)立預(yù)后因子（HR:2.84,95%CI 1.23–3.61,p=0.007）。同樣，在胃癌中，F(xiàn)u等人（2022年）證明高5hmC是OS（風(fēng)險(xiǎn)比[HR]=0.61,95%CI0.38–0.98,p=0.04）和較低腫瘤階段（HR=0.32,95%CI0.13–0.77,p=0.011）的獨(dú)立、有利預(yù)測(cè)因子。
游離細(xì)胞5hmC標(biāo)記也可用于癌癥預(yù)后或患者風(fēng)險(xiǎn)分層。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）中，Chiu等人（2019年）創(chuàng)建了一個(gè)基于29個(gè)5hmC基因的加權(quán)預(yù)后（wp）模型，該模型在預(yù)測(cè)無(wú)進(jìn)展生存期（EFS）和OS方面實(shí)現(xiàn)了96%的準(zhǔn)確性、86%的靈敏度和100%的特異性。高加權(quán)預(yù)后（wp-score）的患者與低wp-score的患者相比，OS和EFS顯著更差。5hmC模型的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性超過(guò)了現(xiàn)有的DLBCL預(yù)后因子，如乳酸脫氫酶水平升高、激活的B細(xì)胞型DLCBL和高國(guó)際預(yù)后指數(shù)（準(zhǔn)確性=36–81%,靈敏度=56–80%,特異性=29–89%）。
在肝細(xì)胞癌（HCC）中，Cai等人（2021年）使用cfDNA 5hmC標(biāo)記和兩個(gè)HCC蛋白生物標(biāo)志物（甲胎蛋白[AFP]和去γ-羧基凝血酶原[DCP]，表2）開發(fā)了一個(gè)HCC評(píng)分。高HCC評(píng)分與HCC的臨床病理預(yù)后因子，如微血管侵犯(MVI)、腫瘤大小和腫瘤階段，呈正相關(guān)，并且與更高的復(fù)發(fā)率、更短的無(wú)復(fù)發(fā)生存期和更短的OS顯著相關(guān)。同時(shí)，HCC評(píng)分也與實(shí)時(shí)腫瘤負(fù)擔(dān)動(dòng)態(tài)正相關(guān)，表明其預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的潛力。然而，這一發(fā)現(xiàn)受到研究樣本量小的限制。
在另一項(xiàng)研究中，Shao等人（2023年）使用基于H3K4me3標(biāo)記的前500個(gè)最可變cfDNA 5hmC區(qū)域的無(wú)監(jiān)督分層聚類，將54名急性髓系白血�。ˋML）患者分為三個(gè)聚類。第三聚類在TET2啟動(dòng)子中表現(xiàn)出最低的5hmC水平，最短的OS和最高的白血病負(fù)擔(dān)。第三聚類和第一聚類之間的差異性羥甲基化區(qū)域（DhMR）富集在與不良預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞生存/增殖通路中（例如，mTOR、ERK/MAPK和胰島素受體信號(hào)通路）。
同樣，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，Shao等人（2024年）使用17個(gè)5hmC基因標(biāo)記構(gòu)建一個(gè)預(yù)后模型。低wp-score患者與高wp-score患者相比，平均OS（18.8vs.5.2個(gè)月，p=0.0006;HR0.22,95%CI0.09–0.57）和平均PFS（8.8vs.3.3個(gè)月，p=0.054;HR0.45;95%CI0.20–1.00）顯著更長(zhǎng)。預(yù)后評(píng)分在預(yù)測(cè)生存結(jié)果方面比已知的臨床因子（如年齡、性別、吸煙史和腫瘤階段）更準(zhǔn)確。
總的來(lái)說(shuō)，這些研究表明游離細(xì)胞和基于組織的5hmC模式可以作為癌癥的預(yù)后生物標(biāo)志物。對(duì)這些5hmC模式背后的基因和通路進(jìn)行進(jìn)一步的研究，將為導(dǎo)致不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因子提供更深入的見解。
DNA羥甲基化整合的多組學(xué)分析
癌癥是幾個(gè)潛在生物網(wǎng)絡(luò)的總和，而不僅僅是個(gè)體現(xiàn)象。因此，研究DNA 5hmC與其他生物學(xué)層面（如甲基化組學(xué)、片段組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)）的整合和互作日益增加。特別是研究cfDNA片段特征（片段組學(xué)），如大小、末端基序、鋸齒末端、核小體定位和覆蓋范圍，可以揭示腫瘤和非腫瘤DNA之間的差異。例如，ctDNA片段長(zhǎng)度通常比cfDNA片段短（ctDNA中約145bp，cfDNA中約166bp）。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，Hu等人（2022年）開發(fā)了一個(gè)整合了5hmC和片段組學(xué)模型的早期檢測(cè)模型。他們使用37個(gè)cfDNA 5hmC標(biāo)記和48個(gè)片段特征（在不同窗口中短片段與長(zhǎng)片段的比例），該模型能夠區(qū)分NSCLC患者和非癌癥對(duì)照組，并在兩個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列中實(shí)現(xiàn)了86-94%的AUC值，83-88%的靈敏度和78-90%的特異性。此外，這個(gè)整合模型的表現(xiàn)優(yōu)于單獨(dú)的5hmC和片段模型，突出了將片段組學(xué)長(zhǎng)度與cfDNA 5hmC結(jié)合用于癌癥檢測(cè)的價(jià)值。在一項(xiàng)泛癌研究中，Zhang等人（2023年）使用5hmC標(biāo)記和多個(gè)cfDNA片段特征（包括大小、覆蓋范圍和優(yōu)選末端）建立了一個(gè)診斷模型。該模型實(shí)現(xiàn)了高AUC值、靈敏度和特異性，展示了整合5hmC和片段特征用于癌癥診斷的潛力。整合的5hmC和片段組學(xué)模型也已在其他癌癥的早期檢測(cè)中進(jìn)行了研究。
以前的研究小組還探索了5mC、5hmC和基因表達(dá)之間的互作，以更深入地理解癌癥背后的遺傳和表觀遺傳模式。Shi等人（2023年）結(jié)合了基因組、轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和羥甲基化組的數(shù)據(jù)，以更好地理解膀胱癌復(fù)發(fā)的發(fā)展。他們證明盡管膀胱癌沒有已知的驅(qū)動(dòng)突變，但5hmC或5mC誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化與膀胱癌復(fù)發(fā)和腫瘤免疫逃逸相關(guān)通路有關(guān)。表明表觀遺傳改變?cè)诎螂装⿵?fù)發(fā)中可能比基因組突變發(fā)揮更顯著的作用。在兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）癌癥中，Lee等人（2024年）整合了5mC、5hmC和單核RNA-seq數(shù)據(jù)，以研究細(xì)胞類型組成對(duì)表觀遺傳學(xué)的影響。作者發(fā)現(xiàn)5mC和5hmC的豐度和變化受到腫瘤組成和異質(zhì)性的強(qiáng)烈影響。他們還觀察到在腫瘤組織中5mC和5hmC的全基因組失調(diào)的普遍性，盡管5hmC在基因組中的豐度明顯低于5mC，這表明5hmC在腫瘤發(fā)生中具有獨(dú)立且至關(guān)重要的作用。
因此，將5hmC與其他組學(xué)數(shù)據(jù)集整合為增強(qiáng)當(dāng)前癌癥生物標(biāo)志物提供了機(jī)會(huì)，并加深了對(duì)5hmC模式和癌癥病理生理學(xué)的理解。
DNA羥甲基化靶點(diǎn)作為癌癥潛在治療策略
盡管已有多項(xiàng)研究報(bào)道了癌癥中5hmC的全局和局部模式，但推動(dòng)這些變化的具體機(jī)制仍然難以捉摸。5hmC水平的降低與TET活性受損有關(guān)，這可能是由于TET基因的失活突變、TET表達(dá)下調(diào)以及TET輔因子和底物抑制。先前的研究表明，過(guò)表達(dá)TET可以顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而敲低TET則表現(xiàn)出相反的表型。因此，靶向TET可能為癌癥治療提供一種潛在策略。目前還沒有批準(zhǔn)的藥物專門靶向TET蛋白進(jìn)行癌癥治療。然而，先前的急性髓系白血�。ˋML）藥物篩選研究揭示了如NSC-311068和NSC-370284等化合物，它們可以抑制TET1表達(dá)，進(jìn)而降低5hmC水平，以抑制體外和體內(nèi)的細(xì)胞活力和腫瘤進(jìn)展。另一種新興策略涉及使用CRISPR/cas9表觀基因組編輯工具，其中去活化的cas9（dcas9）與TET蛋白（TETCD）的催化域融合，以靶向并去甲基化由引導(dǎo)RNA（sgRNA）指定基因區(qū)域的DNA。Choudhury等人（2016年）使用CRISPR/dCas9-TET1CD系統(tǒng)進(jìn)行的初步工作展示了體外BRCA1啟動(dòng)子的成功去甲基化，從而恢復(fù)BRCA1表達(dá)，并抑制了多種癌細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)。同樣，Xu等人（2018年）使用與TET3CD耦合的高保真度dcas9去甲基化腎臟纖維化中的高甲基化抗纖維化基因，展示了體外和體內(nèi)抗纖維化基因Rasal1和Klotho的成功基因特異性重新激活。未來(lái)的研究方向，如優(yōu)化sgRNA結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)于目標(biāo)的位置和研究脫靶效應(yīng)，將提高這種CRISPR/Cas9技術(shù)的廣度和實(shí)用性。TET也可以通過(guò)改變其底物和輔因子的可用性間接修飾。例如，α-酮戊二酸（α-KG）是三羧酸循環(huán)（TCA）中的關(guān)鍵中間體，也是TET在去甲基化途徑中的底物。Liu等人（2023年）的研究表明，α-KG補(bǔ)充增加了黑色素瘤中TET2/3的活性，導(dǎo)致PD-L1啟動(dòng)子處5hmC水平升高，提高了ICI的療效。異檸檬酸脫氫酶（IDH）基因IDH1和IDH2的突變也可能影響TET活性，因?yàn)橥蛔兠笇?alpha;-KG轉(zhuǎn)化為2-羥基戊二酸，這是TET催化位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。然而，IDH突變是否是癌癥中5hmC耗竭的主要原因仍不確定。維生素C是另一種可以增強(qiáng)TET活性的輔因子，從而增加5hmC水平。Peng等人（2018年）證明，維生素C處理可以以時(shí)間和濃度依賴性的方式恢復(fù)5hmC水平，同時(shí)抑制膀胱和腎臟癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。盡管TET活性增加，但TET1/2/3的表達(dá)水平并沒有顯著變化，表明維生素C增強(qiáng)了TET活性，而不是表達(dá)水平。在其他癌癥中也觀察到了類似的發(fā)現(xiàn)，表明維生素C治療可能是癌癥的潛在選擇。 盡管α-KG和維生素C在改變TET活性方面顯示出潛力，但這些輔因子也參與多種細(xì)胞過(guò)程，因此可能導(dǎo)致意想不到的副作用。需要進(jìn)一步研究這些輔因子改變的確切機(jī)制和后果。
挑戰(zhàn)和未來(lái)方向
選擇正確的5hmC檢測(cè)方法
5hmC檢測(cè)方法進(jìn)步導(dǎo)致了研究羥甲基化組的全基因組分析策略的改進(jìn)。目前的技術(shù)現(xiàn)在可以區(qū)分各種胞嘧啶修飾（表1），從而可以單獨(dú)評(píng)估每種修飾在腫瘤發(fā)生中的作用。同時(shí)對(duì)基因組和表觀基因組進(jìn)行測(cè)序的新方法具有巨大的前景，為使用單一工作流程進(jìn)行多組學(xué)分析提供了機(jī)會(huì)。然而，DNA輸入要求和測(cè)序成本等挑戰(zhàn)依然存在。此外，隨著cfDNA輸入的使用不斷增長(zhǎng)，即使在低濃度下，也必須有能夠檢測(cè)5hmC的靈敏檢測(cè)方法。盡管如此，基于液體活檢技術(shù)的發(fā)展正在出現(xiàn)，可以提高cfDNA檢測(cè)的靈敏度和特異性。方法的選擇可能會(huì)受到分析解決這些障礙的程度或所選方法所需試劑的可用性的影響。
cfDNA羥甲基化的多組學(xué)分析
對(duì)癌癥檢測(cè)、預(yù)后和預(yù)測(cè)治療結(jié)果的cfDNA羥甲基化組進(jìn)行分析正在取得進(jìn)展。將5hmC數(shù)據(jù)與其他組學(xué)相結(jié)合，不僅可以補(bǔ)充當(dāng)前的生物標(biāo)志物模型，還可以更全面地了解癌癥生物學(xué)。然而，在臨床實(shí)施可行之前，需要解決幾個(gè)挑戰(zhàn)。
首先，每個(gè)血漿樣本中ctDNA含量有限（5-10ng/mL），這對(duì)多組學(xué)研究構(gòu)成挑戰(zhàn)，因?yàn)檫M(jìn)行多次檢測(cè)時(shí)ctDNA含量往往不足。
其次，多組學(xué)cfDNA研究的標(biāo)準(zhǔn)化方法仍然缺乏，因?yàn)檫@仍然是一個(gè)不斷發(fā)展的領(lǐng)域。開源生物信息學(xué)管道、ctDNA解卷積方法和合成參考對(duì)照（即DNA尖峰）的開發(fā)將有助于確保集成數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和可比性。
第三，來(lái)自腫瘤微環(huán)境或外周血白細(xì)胞中cfDNA的表觀遺傳信號(hào)可能會(huì)破壞或稀釋正在研究的ctDNA信號(hào)。因此，至關(guān)重要的是要有適當(dāng)?shù)墓ぞ邅?lái)細(xì)化腫瘤特異性5hmC信號(hào)，同時(shí)濾除背景、非腫瘤噪聲。目前的工具包括calling ctDNA變體和過(guò)濾外周血白細(xì)胞信號(hào)。
最后，擁有適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)工具和基礎(chǔ)設(shè)施對(duì)于支持新發(fā)現(xiàn)的整合和分析至關(guān)重要。
結(jié)論
DNA羥甲基化作為癌癥檢測(cè)、預(yù)后和治療反應(yīng)預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物具有巨大的前景。分析方法的進(jìn)展，特別是cfDNA方法的進(jìn)步，使人們能夠開發(fā)出高靈敏度和特異性的工具來(lái)檢測(cè)羥甲基化。通過(guò)將5hmC數(shù)據(jù)與其他多組學(xué)數(shù)據(jù)集整合，可以進(jìn)一步增強(qiáng)這些發(fā)展，提供對(duì)癌癥機(jī)制的更全面了解，并有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，在更廣泛地臨床采用5hmC生物標(biāo)志物之前，仍有幾個(gè)挑戰(zhàn)需要解決。這些包括進(jìn)一步驗(yàn)證當(dāng)前的生物標(biāo)志物，解決測(cè)序和輸入相關(guān)的問(wèn)題，以及建立必要的生物信息學(xué)工具和分析基礎(chǔ)設(shè)施。盡管如此，隨著對(duì)5hmC機(jī)制和檢測(cè)方法的持續(xù)研究，5hmC有可能成為改善癌癥治療的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。
參考文獻(xiàn)：
Li JJN, Liu G, Lok BH. Cell-Free DNA Hydroxymethylation in Cancer: Current and Emerging Detection Methods and Clinical Applications. Genes (Basel). 2024 Sep 3;15(9) pii: genes15091160. doi: 10.3390/genes15091160. PubMed PMID: 39336751.
DNA羥甲基化的生物學(xué)功能和機(jī)制
DNA去甲基化通路中的羥甲基化
DNA甲基化（5-甲基胞嘧啶，5mC）是哺乳動(dòng)物DNA中研究最為深入的表觀遺傳標(biāo)記，對(duì)基因調(diào)控至關(guān)重要。5mC可以通過(guò)DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）從S-腺苷甲硫氨酸（SAM）向胞嘧啶的5位共價(jià)轉(zhuǎn)移甲基基團(tuán)來(lái)酶促產(chǎn)生。在主動(dòng)去甲基化通路中，DNA 5hmC通過(guò)TET雙加氧酶（例如TET1、TET2和TET3）氧化5mC產(chǎn)生（圖1）。這一反應(yīng)需要α-酮戊二酸（α-KG）和氧氣，在鐵和抗壞血酸（維生素C）下產(chǎn)生5hmC、琥珀酸和二氧化碳。TET酶進(jìn)一步氧化5hmC產(chǎn)生5-甲酰胞嘧啶（5fC）和5-羧基胞嘧啶（5caC），盡管這些中間體的存在于5hmC的頻率要低得多。與5hmC不同，5fC和5caC不穩(wěn)定，分別被胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）和基礎(chǔ)切除修復(fù)（BER）機(jī)制切除和修復(fù)，恢復(fù)為未修飾的胞嘧啶形式。5hmC也可以通過(guò)激活誘導(dǎo)的胞嘧啶脫氨酶（AID）/載脂蛋白B mRNA編輯酶，催化多肽類（APOBEC）脫氨成5-羥甲基尿嘧啶（5mU），然后通過(guò)BER去甲基化。通過(guò)復(fù)制稀釋也可以發(fā)生胞嘧啶修飾的被動(dòng)去甲基化。
圖1：活性DNA去甲基化通路。
與5mC、5fC和5caC相比，TET酶和TDG-BER耦聯(lián)機(jī)制對(duì)5hmC的親和力較低，表明5hmC是穩(wěn)定的，并不容易去甲基化。此外，5hmC可以在多次細(xì)胞分裂中持續(xù)存在，表明它可能在去甲基化通路之外具有重要的生物學(xué)功能。
DNA 羥甲基化的生物學(xué)功能和分布
5hmC在胚胎發(fā)育、干細(xì)胞多能性、T淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞）的缺失和分化、以及不同疾病的病因?qū)W等多種生物過(guò)程中發(fā)揮重要作用，并在活躍的基因調(diào)控中扮演著關(guān)鍵角色。5hmC主要在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域中富集，如基因體、增強(qiáng)子以及啟動(dòng)子周圍（圖2）。富含5hmC區(qū)域通常位于活躍的組蛋白修飾（例如H3K4me2和H3K4me3）和組蛋白標(biāo)記的增強(qiáng)子（例如H3K4me1和H3K27ac）附近，表明它可能參與調(diào)節(jié)活躍的基因表達(dá)（圖2）。許多研究表明5hmC水平與基因表達(dá)之間存在正相關(guān)。
圖2：全基因組和位點(diǎn)特異性DNA羥甲基化模式。
游離DNA和羥甲基化組
對(duì)游離細(xì)胞羥甲基化的研究開啟于2017年，song等人開發(fā)了一種高度敏感的化學(xué)標(biāo)記檢測(cè)方法，能夠檢測(cè)到少量cfDNA輸入中的低水平5hmC。從那時(shí)起開始在各種臨床應(yīng)用中被研究，包括早期癌癥檢測(cè)和預(yù)測(cè)癌癥結(jié)果。盡管與組織相比，cfDNA中的5hmC水平通常較低，但先前的研究表明cfDNA 5hmC模式和動(dòng)態(tài)反映了組織中發(fā)生變化。此外，由于5hmC相對(duì)穩(wěn)定，基因組DNA上的5hmC標(biāo)記可以在cfDNA片段中重現(xiàn)，表明它有潛力作為一種微創(chuàng)的癌癥生物標(biāo)志物。
癌癥中的DNA羥甲基化模式
DNA羥甲基化模式可以在全局（全基因組）或局部（位點(diǎn)特異性基因組，圖2）范圍內(nèi)進(jìn)行評(píng)估。在各種類型的癌癥中，包括膀胱、腦部、胰腺和乳腺癌，都檢測(cè)到全基因組5hmC丟失。在某些情況下，5hmC水平更大降低與更侵襲性腫瘤和更差預(yù)后相關(guān)。在皮膚T細(xì)胞淋巴瘤（CTCL）細(xì)胞系中，Qiu等人（2018年）觀察到隨著腫瘤侵襲性增加，5hmC逐漸丟失，其中大細(xì)胞轉(zhuǎn)化的CTCL細(xì)胞系顯示出最大的5hmC百分比降低，其次是未轉(zhuǎn)化的CTCL和前CTCL斑塊和補(bǔ)丁。同樣，Song等人（2017年）發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，cfDNA中的5hmC呈現(xiàn)階段依賴性缺失，其中轉(zhuǎn)移性NSCLC顯示出與非轉(zhuǎn)移性NSCLC和健康個(gè)體相比，歸一化羥甲基化區(qū)域的最低水平。但這些發(fā)現(xiàn)可能因所研究的組織類型和人群而異。例如，與Song等人（2017年）的研究不同，其他在中國(guó)人群中進(jìn)行的NSCLC研究報(bào)告稱，與健康對(duì)照組相比，癌癥中的5hmC水平全基因組增加。盡管如此，整體5hmC模式在癌癥和非癌癥對(duì)照之間顯示出不同的特征。
癌癥中也在轉(zhuǎn)錄活躍區(qū)域描述了特定基因位點(diǎn)的5hmC增加。在結(jié)直腸癌的cfDNA研究中，Li等人（2017年）報(bào)告了5hmC在基因體、開放染色質(zhì)區(qū)域（DNaseI高敏感位點(diǎn)）以及帶有活躍組蛋白修飾（H3K27ac,H3K4me1,H3K9me1）的區(qū)域富集。在另一項(xiàng)研究中，Sjöstrom等人（2022年）揭示了前列腺癌驅(qū)動(dòng)基因的增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游的局部5hmC富集，尤其是雄激素受體（AR）和叉頭盒蛋白A1（FOXA1），與其基因表達(dá)相關(guān)。表明5hmC失調(diào)可能導(dǎo)致疾病狀態(tài)，即使在驅(qū)動(dòng)基因上沒有遺傳突變。
總的來(lái)說(shuō)，這些研究表明整體和局部5hmC模式是強(qiáng)大的標(biāo)記物，能夠區(qū)分癌癥和非癌癥樣本，暗示了5hmC作為癌癥生物標(biāo)志物的潛力，盡管還需要進(jìn)一步研究。
羥甲基化檢測(cè)方法的演變
在過(guò)去十年中，對(duì)羥甲基化組的定量和分析取得了顯著進(jìn)展。早期5hmC分析研究主要通過(guò)質(zhì)譜、薄層色譜、高效液相色譜（HPLC）、免疫檢測(cè)和光譜技術(shù)等定量方法。雖然這些方法能夠準(zhǔn)確定量5hmC水平，但其樣本制備復(fù)雜性、高昂的設(shè)備和試劑成本以及低分辨率使得它們?cè)谂R床環(huán)境中難以實(shí)施。自那以后，科學(xué)家們開發(fā)出了基于測(cè)序的方法，用于全基因組和單堿基分辨率的分析。表1總結(jié)了最常見的5hmC分析技術(shù)。
表1：基于DNA羥甲基化測(cè)序的檢測(cè)方法。
亞硫酸鹽測(cè)序方法
亞硫酸鹽測(cè)序（BS-seq）是DNA甲基化分析的黃金標(biāo)準(zhǔn)方法，能夠提供全基因組范圍內(nèi)的單堿基分辨率評(píng)估。傳統(tǒng)的BS-seq用亞硫酸鈉處理DNA，將未修飾的胞嘧啶（C）、5fC和5caC脫氨基成尿嘧啶（U），并將5hmC轉(zhuǎn)化為胞嘧啶-5-甲磺酸（CMS），而5mC保持不變。由于5mC和CMS的最終讀數(shù)（readout）都是胞嘧啶，BS-seq的一個(gè)限制是無(wú)法區(qū)分5mC和5hmC。為了克服這一障礙，可以在亞硫酸鹽處理前添加化學(xué)物質(zhì)來(lái)保護(hù)或修飾堿基，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)甲基化狀態(tài)的更精確區(qū)分。 氧化亞硫酸鹽測(cè)序（OxBS-seq）和TET輔助亞硫酸鹽測(cè)序（TAB-seq）是改良亞硫酸鹽技術(shù)的示例。OxBS-seq利用高碘酸鉀（KRuO4）將5hmC氧化成5fC。由于5fC是一種不穩(wěn)定的中間體，TDG和BER機(jī)制會(huì)將其再轉(zhuǎn)化為胞嘧啶，使其在亞硫酸鹽處理下發(fā)生脫氨基。與傳統(tǒng)亞硫酸鹽測(cè)序讀數(shù)比較，可以識(shí)別5hmC（BS-seq中的“C”和OxBS-seq中的“T”）。TAB-seq依賴于T4噬菌體β-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶（T4-βGT）將葡萄糖基團(tuán)轉(zhuǎn)移到5hmC上，保護(hù)其不受TET1氧化。經(jīng)過(guò)氧化和亞硫酸鹽處理后，最終讀數(shù)（readout）允許直接識(shí)別5hmC（5hmC讀作“C”，而胞嘧啶、5mC和其他氧化衍生物讀作“T”）。
酶促和親和方法
為了克服基于亞硫酸鹽方法的局限性，非亞硫酸鹽技術(shù)使用化學(xué)物質(zhì)、酶和抗體來(lái)葡萄糖基化、脫氨基、氧化或選擇性地拉下5hmC，以捕獲其全基因組分布。這些策略反過(guò)來(lái)提高了5hmC分析技術(shù)的靈敏度、特異性和可行性，為臨床應(yīng)用的過(guò)渡提供了便利。
- 化學(xué)捕獲和葡萄糖基化技術(shù)
5hmC選擇性化學(xué)標(biāo)記（HMe-SEAL）是另一種基于葡萄糖基化的技術(shù)，它利用T4-βGT將修飾的疊氮葡萄糖分子轉(zhuǎn)移到5hmC上。隨后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)添加生物素標(biāo)簽，以及隨后的鏈霉親和素珠子拉下生物素化片段。目前，HMe-SEAL優(yōu)化版本廣泛用于稀有細(xì)胞群體（Nano-hmC-Seal）和游離細(xì)胞DNA的5hmC分析。然而，像其他富集技術(shù)一樣，HMe-SEAL無(wú)法對(duì)5hmC位點(diǎn)進(jìn)行單堿基分辨率分析，限制其定量5hmC水平。盡管如此，HMe-SEAL為cfDNA研究提供了一個(gè)機(jī)會(huì)，因?yàn)樗枰腄NA起始量低，并且可以有效地富集含有5hmC的片段，從而實(shí)現(xiàn)更具成本效益的測(cè)序。
同樣，J結(jié)合蛋白1測(cè)序（JBP1-seq）也依賴于T4-βGT來(lái)葡萄糖基化5hmC。J結(jié)合蛋白1是葡萄糖基化5hmC的天然抗體。在一項(xiàng)比較JBP1-seq與HMe-SEAL和其他基于親和性的5hmC分析方法的研究中，JBP1-seq顯示出顯著不同的5hmC譜圖，并且無(wú)法將染色質(zhì)狀態(tài)與5hmC模式相關(guān)聯(lián)。此外，它可能偏向于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，導(dǎo)致5hmC的富集度降低。然而，優(yōu)化的JBP1-seq工作流程已經(jīng)展示了改進(jìn)的5hmC富集能力，更快的性能（4.5小時(shí)）和降低的DNA起始量要求。需要進(jìn)一步驗(yàn)證以全面評(píng)估這種優(yōu)化工作流程的性能。
其他葡萄糖基化方法包括Jump-seq和5hmC連接寡核苷酸引導(dǎo)測(cè)序（hmTOP-seq）。Jump-seq和hmTOP-seq都使用T4-βGT將疊氮葡萄糖附著在5hmC上，然后通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)標(biāo)記帶有發(fā)夾或連接的寡核苷酸，并延伸引物以定位5hmC。最近，hmTOP-seq也被用于檢測(cè)cfDNA中的5hmC。盡管研究圍繞母血cfDNA的產(chǎn)前檢測(cè)展開，hmTOP-seq在極低測(cè)序深度下檢測(cè)胎兒唐氏綜合癥的準(zhǔn)確性達(dá)到了100%。表明它有潛力成為分析游離細(xì)胞羥甲基化組的工具。然而，需要注意的是，Jump-seq和hmTOP-seq都依賴于間接方法來(lái)定量5hmC，可能會(huì)在測(cè)序后引入偏差和假象。此外，Jump-seq往往對(duì)高CpG密度區(qū)域有偏倚，如果5hmC峰太接近可能會(huì)表現(xiàn)不佳。
② DNA脫氨方法
AID/APOBEC酶是一種替代的DNA脫氨方法，無(wú)需亞硫酸鹽處理過(guò)程中產(chǎn)生的不穩(wěn)定的磺化中間體。這一反應(yīng)使用鋅輔因子來(lái)脫氨基單鏈DNA上的胞嘧啶。第一個(gè)采用這種策略的技術(shù)是APOBEC偶聯(lián)表觀遺傳測(cè)序（ACE-seq）。在ACE-seq中，5hmC首先通過(guò)T4-βGT葡萄糖基化以保護(hù)其不受隨后APOBEC3A脫氨基的影響。另一方面，5mC和其他未修飾的胞嘧啶將在APOBEC3A處理下被脫氨基。ACE-seq的一個(gè)主要優(yōu)勢(shì)是，ACE-seq可以實(shí)現(xiàn)5hmC的單堿基分辨率比對(duì)，所需的DNA 起始量比BS-seq少1000倍。酶促甲基測(cè)序（EM-seq）遵循與ACE-seq相同的工作流程，但在葡萄糖基化之前使用TET2氧化5mC和5hmC。
單步脫氨基測(cè)序（SSD-seq）是另一種脫氨基技術(shù)，它利用特別設(shè)計(jì)的蛋白eA3A-v10來(lái)脫氨基胞嘧啶和5mC，但不脫氨基5hmC。這種方法消除了脫氨基前額外的葡萄糖基化或氧化步驟的需要。此外，eA3A-v10的脫氨基使用溫和的脫氨基反應(yīng)，克服了亞硫酸鹽處理對(duì)DNA損傷的限制。像ACE-seq一樣，需要注意的是5hmC的reads可能包括5fC和5caC的痕跡，這可能會(huì)高估5hmC水平。然而，由于它們的普遍性和穩(wěn)定性遠(yuǎn)低于5hmC，可能不會(huì)對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生顯著影響。
新的脫氨基方法將脫氨基與現(xiàn)有的分析技術(shù)相結(jié)合，以提高全基因組5hmC檢測(cè)的分辨率。DNA免疫沉淀偶聯(lián)化學(xué)修飾輔助亞硫酸鹽測(cè)序（DIP-CAB-seq）是一種三步策略：（1）葡萄糖基化、點(diǎn)擊化學(xué)和生物素-鏈霉親和素互作，如HMe-SEAL，（2）APOBEC脫氨基，以及（3）單鏈測(cè)序。盡管DIP-CAB-Seq工作量大，但它展示了與HMe-SEAL相當(dāng)?shù)?hmC富集能力，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了改進(jìn)的單堿基分辨率檢測(cè)。同樣，基于富集的單堿基分辨率5hmC測(cè)序（EBS-seq）遵循類似的工作流程，其中APOBEC脫氨基發(fā)生在鏈霉親和素珠子拉下之前。即使在5hmC含量低的樣本中，如人類癌細(xì)胞系和組織，也能有效地檢測(cè)到5hmC。
- 基于氧化策略
④ 基于抗體方法
特異性靶向5hmC或其衍生物的抗體也可以用來(lái)捕獲羥甲基化DNA片段。羥甲基化DNA免疫沉淀（hmeDIP）利用單克隆抗5hmC抗體來(lái)捕獲和拉下羥甲基化DNA，已廣泛用于癌癥組織和細(xì)胞系中5hmC的局部和全基因組分析。盡管基于抗體的分析技術(shù)受到抗體結(jié)合效率的變異性限制，可能偏向于高羥甲基化區(qū)域，但它們具有成本效益、易于實(shí)施，并且可以對(duì)5hmC具有高度特異性。
DNA羥甲基化及其臨床應(yīng)用
5hmC作為一種有前途的癌癥生物標(biāo)志物，展現(xiàn)出獨(dú)特的全局和局部模式，能夠區(qū)分癌癥和非癌癥樣本。以往的研究已經(jīng)探索了它作為癌癥的診斷、預(yù)后和預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物的潛力，強(qiáng)調(diào)了它在癌癥管理中的實(shí)用性。圖3和表2突出了5hmC作為癌癥生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用示例。
圖3：DNA羥甲基化在癌癥中的臨床應(yīng)用。
表2：DNA羥甲基化作為癌癥生物標(biāo)志物示例。
DNA羥甲基化作為癌癥檢測(cè)的生物標(biāo)志物
早期發(fā)現(xiàn)癌癥可以使得治療更加有效，預(yù)后更好，因此擁有可靠的診斷生物標(biāo)志物至關(guān)重要。然而，由于早期腫瘤含量極低，尤其是循環(huán)腫瘤DNA（ctDNA），這使得檢測(cè)變得具有挑戰(zhàn)性。整體和特定基因位點(diǎn)的5hmC模式是很有前景的診斷生物標(biāo)志物。
在一項(xiàng)泛癌研究中，Shao等人（2022年）利用健康個(gè)體和患有膀胱、乳腺、結(jié)直腸、腎臟、肺或前列腺癌患者的cfDNA建立了一個(gè)24個(gè)5hmC基因模型。他們的模型在驗(yàn)證隊(duì)列中成功地區(qū)分了癌癥和健康個(gè)體（AUC=91%，靈敏度=68.6%，特異性=96.6%）。當(dāng)單獨(dú)考慮每種癌癥時(shí)，他們的癌癥特異性加權(quán)診斷（wd）模型實(shí)現(xiàn)了從94%到99.8%的AUC，靈敏度從80%到96%，特異性從96%到100%。對(duì)于早期疾病的檢測(cè)性能也很高，泛癌靈敏度在71.4%和81.3%之間，癌癥特異性標(biāo)志物在I期和II期疾病中分別為89.3%和94.1%。
在一項(xiàng)多中心研究METHOD-2（NCT03676075）中，Chang等人（2024年）還開發(fā)了一個(gè)能夠區(qū)分I-III期結(jié)直腸癌患者和非癌癥對(duì)照的cfDNA 5hmC分類器。他們基于96個(gè)5hmC基因體的模型在內(nèi)部驗(yàn)證中實(shí)現(xiàn)了94.3%的AUC，在外部驗(yàn)證中實(shí)現(xiàn)了90.7%的AUC。他們的cfDNA 5hmC基礎(chǔ)分類器的性能超過(guò)了經(jīng)典的結(jié)直腸癌生物標(biāo)志物癌胚抗原（CEA），后者在內(nèi)部和外部驗(yàn)證隊(duì)列中的AUC分別為77.1%和73.2%。在90%的特異性下，基于5hmC的評(píng)分在I期和II/III期結(jié)直腸癌中的靈敏度為73.5%和85.3%，而CEA在同一階段的靈敏度分別為29.4%和47.2%。在肝細(xì)胞癌、肺癌和結(jié)直腸癌的研究也表明，基于5hmC的模型可以超越傳統(tǒng)的診斷生物標(biāo)志物，突顯了5hmC在癌癥檢測(cè)中的潛力。
盡管全局和基因特異性的cfDNA 5hmC模式作為癌癥的診斷生物標(biāo)志物具有潛力，甚至是對(duì)于早期疾病，但在這些模型可以轉(zhuǎn)化為臨床實(shí)踐之前，仍有幾個(gè)問(wèn)題需要解決。首先，當(dāng)前的診斷模型往往只關(guān)注基因特異性的5hmC標(biāo)記，而其他富含5hmC的調(diào)控因子，如增強(qiáng)子，往往被忽視。將其他調(diào)控因子納入這些模型可以提高性能并改善我們對(duì)觀察到的5hmC模式背后的生物學(xué)的理解。其次，未來(lái)的研究應(yīng)該優(yōu)先驗(yàn)證現(xiàn)有的基因標(biāo)記模型，特別是在不同的地理和種族群體中，以評(píng)估這些模型的普適性。
DNA羥甲基化在癌癥中的預(yù)后價(jià)值
除了早期檢測(cè)，有證據(jù)支持5hmC分析在癌癥預(yù)后中的價(jià)值。例如，在肝內(nèi)膽管癌（ICC）中，Dong等人（2015年）表明，與高/陽(yáng)性5hmC水平相比，組織中低或陰性5hmC水平與更高的腫瘤階段、更多的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、更短的總生存期和更差的無(wú)病生存期相關(guān)。同樣，Kuang等人（2024年）揭示了TET2/5hmC子宮內(nèi)膜腺癌與其他TET2和5hmC表達(dá)組合相比，與最差的總生存期相關(guān)（p<0.001）。相比之下，TET2/5hmC子宮內(nèi)膜癌與分化良好的細(xì)胞、最小的肌層侵襲、陰性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和較低的腫瘤階段顯著相關(guān)。多變量分析進(jìn)一步表明，TET2/5hmC關(guān)系可以作為子宮內(nèi)膜癌的獨(dú)立預(yù)后因子（HR:2.84,95%CI 1.23–3.61,p=0.007）。同樣，在胃癌中，F(xiàn)u等人（2022年）證明高5hmC是OS（風(fēng)險(xiǎn)比[HR]=0.61,95%CI0.38–0.98,p=0.04）和較低腫瘤階段（HR=0.32,95%CI0.13–0.77,p=0.011）的獨(dú)立、有利預(yù)測(cè)因子。
游離細(xì)胞5hmC標(biāo)記也可用于癌癥預(yù)后或患者風(fēng)險(xiǎn)分層。在彌漫性大B細(xì)胞淋巴瘤（DLBCL）中，Chiu等人（2019年）創(chuàng)建了一個(gè)基于29個(gè)5hmC基因的加權(quán)預(yù)后（wp）模型，該模型在預(yù)測(cè)無(wú)進(jìn)展生存期（EFS）和OS方面實(shí)現(xiàn)了96%的準(zhǔn)確性、86%的靈敏度和100%的特異性。高加權(quán)預(yù)后（wp-score）的患者與低wp-score的患者相比，OS和EFS顯著更差。5hmC模型的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性超過(guò)了現(xiàn)有的DLBCL預(yù)后因子，如乳酸脫氫酶水平升高、激活的B細(xì)胞型DLCBL和高國(guó)際預(yù)后指數(shù)（準(zhǔn)確性=36–81%,靈敏度=56–80%,特異性=29–89%）。
在肝細(xì)胞癌（HCC）中，Cai等人（2021年）使用cfDNA 5hmC標(biāo)記和兩個(gè)HCC蛋白生物標(biāo)志物（甲胎蛋白[AFP]和去γ-羧基凝血酶原[DCP]，表2）開發(fā)了一個(gè)HCC評(píng)分。高HCC評(píng)分與HCC的臨床病理預(yù)后因子，如微血管侵犯(MVI)、腫瘤大小和腫瘤階段，呈正相關(guān)，并且與更高的復(fù)發(fā)率、更短的無(wú)復(fù)發(fā)生存期和更短的OS顯著相關(guān)。同時(shí)，HCC評(píng)分也與實(shí)時(shí)腫瘤負(fù)擔(dān)動(dòng)態(tài)正相關(guān)，表明其預(yù)測(cè)疾病復(fù)發(fā)的潛力。然而，這一發(fā)現(xiàn)受到研究樣本量小的限制。
在另一項(xiàng)研究中，Shao等人（2023年）使用基于H3K4me3標(biāo)記的前500個(gè)最可變cfDNA 5hmC區(qū)域的無(wú)監(jiān)督分層聚類，將54名急性髓系白血�。ˋML）患者分為三個(gè)聚類。第三聚類在TET2啟動(dòng)子中表現(xiàn)出最低的5hmC水平，最短的OS和最高的白血病負(fù)擔(dān)。第三聚類和第一聚類之間的差異性羥甲基化區(qū)域（DhMR）富集在與不良預(yù)后相關(guān)的細(xì)胞生存/增殖通路中（例如，mTOR、ERK/MAPK和胰島素受體信號(hào)通路）。
同樣，在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，Shao等人（2024年）使用17個(gè)5hmC基因標(biāo)記構(gòu)建一個(gè)預(yù)后模型。低wp-score患者與高wp-score患者相比，平均OS（18.8vs.5.2個(gè)月，p=0.0006;HR0.22,95%CI0.09–0.57）和平均PFS（8.8vs.3.3個(gè)月，p=0.054;HR0.45;95%CI0.20–1.00）顯著更長(zhǎng)。預(yù)后評(píng)分在預(yù)測(cè)生存結(jié)果方面比已知的臨床因子（如年齡、性別、吸煙史和腫瘤階段）更準(zhǔn)確。
總的來(lái)說(shuō)，這些研究表明游離細(xì)胞和基于組織的5hmC模式可以作為癌癥的預(yù)后生物標(biāo)志物。對(duì)這些5hmC模式背后的基因和通路進(jìn)行進(jìn)一步的研究，將為導(dǎo)致不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)因子提供更深入的見解。
DNA羥甲基化整合的多組學(xué)分析
癌癥是幾個(gè)潛在生物網(wǎng)絡(luò)的總和，而不僅僅是個(gè)體現(xiàn)象。因此，研究DNA 5hmC與其他生物學(xué)層面（如甲基化組學(xué)、片段組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)）的整合和互作日益增加。特別是研究cfDNA片段特征（片段組學(xué)），如大小、末端基序、鋸齒末端、核小體定位和覆蓋范圍，可以揭示腫瘤和非腫瘤DNA之間的差異。例如，ctDNA片段長(zhǎng)度通常比cfDNA片段短（ctDNA中約145bp，cfDNA中約166bp）。在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）中，Hu等人（2022年）開發(fā)了一個(gè)整合了5hmC和片段組學(xué)模型的早期檢測(cè)模型。他們使用37個(gè)cfDNA 5hmC標(biāo)記和48個(gè)片段特征（在不同窗口中短片段與長(zhǎng)片段的比例），該模型能夠區(qū)分NSCLC患者和非癌癥對(duì)照組，并在兩個(gè)驗(yàn)證隊(duì)列中實(shí)現(xiàn)了86-94%的AUC值，83-88%的靈敏度和78-90%的特異性。此外，這個(gè)整合模型的表現(xiàn)優(yōu)于單獨(dú)的5hmC和片段模型，突出了將片段組學(xué)長(zhǎng)度與cfDNA 5hmC結(jié)合用于癌癥檢測(cè)的價(jià)值。在一項(xiàng)泛癌研究中，Zhang等人（2023年）使用5hmC標(biāo)記和多個(gè)cfDNA片段特征（包括大小、覆蓋范圍和優(yōu)選末端）建立了一個(gè)診斷模型。該模型實(shí)現(xiàn)了高AUC值、靈敏度和特異性，展示了整合5hmC和片段特征用于癌癥診斷的潛力。整合的5hmC和片段組學(xué)模型也已在其他癌癥的早期檢測(cè)中進(jìn)行了研究。
以前的研究小組還探索了5mC、5hmC和基因表達(dá)之間的互作，以更深入地理解癌癥背后的遺傳和表觀遺傳模式。Shi等人（2023年）結(jié)合了基因組、轉(zhuǎn)錄組、甲基化組和羥甲基化組的數(shù)據(jù)，以更好地理解膀胱癌復(fù)發(fā)的發(fā)展。他們證明盡管膀胱癌沒有已知的驅(qū)動(dòng)突變，但5hmC或5mC誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄變化與膀胱癌復(fù)發(fā)和腫瘤免疫逃逸相關(guān)通路有關(guān)。表明表觀遺傳改變?cè)诎螂装⿵?fù)發(fā)中可能比基因組突變發(fā)揮更顯著的作用。在兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）癌癥中，Lee等人（2024年）整合了5mC、5hmC和單核RNA-seq數(shù)據(jù)，以研究細(xì)胞類型組成對(duì)表觀遺傳學(xué)的影響。作者發(fā)現(xiàn)5mC和5hmC的豐度和變化受到腫瘤組成和異質(zhì)性的強(qiáng)烈影響。他們還觀察到在腫瘤組織中5mC和5hmC的全基因組失調(diào)的普遍性，盡管5hmC在基因組中的豐度明顯低于5mC，這表明5hmC在腫瘤發(fā)生中具有獨(dú)立且至關(guān)重要的作用。
因此，將5hmC與其他組學(xué)數(shù)據(jù)集整合為增強(qiáng)當(dāng)前癌癥生物標(biāo)志物提供了機(jī)會(huì)，并加深了對(duì)5hmC模式和癌癥病理生理學(xué)的理解。
DNA羥甲基化靶點(diǎn)作為癌癥潛在治療策略
盡管已有多項(xiàng)研究報(bào)道了癌癥中5hmC的全局和局部模式，但推動(dòng)這些變化的具體機(jī)制仍然難以捉摸。5hmC水平的降低與TET活性受損有關(guān)，這可能是由于TET基因的失活突變、TET表達(dá)下調(diào)以及TET輔因子和底物抑制。先前的研究表明，過(guò)表達(dá)TET可以顯著抑制細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，而敲低TET則表現(xiàn)出相反的表型。因此，靶向TET可能為癌癥治療提供一種潛在策略。目前還沒有批準(zhǔn)的藥物專門靶向TET蛋白進(jìn)行癌癥治療。然而，先前的急性髓系白血�。ˋML）藥物篩選研究揭示了如NSC-311068和NSC-370284等化合物，它們可以抑制TET1表達(dá)，進(jìn)而降低5hmC水平，以抑制體外和體內(nèi)的細(xì)胞活力和腫瘤進(jìn)展。另一種新興策略涉及使用CRISPR/cas9表觀基因組編輯工具，其中去活化的cas9（dcas9）與TET蛋白（TETCD）的催化域融合，以靶向并去甲基化由引導(dǎo)RNA（sgRNA）指定基因區(qū)域的DNA。Choudhury等人（2016年）使用CRISPR/dCas9-TET1CD系統(tǒng)進(jìn)行的初步工作展示了體外BRCA1啟動(dòng)子的成功去甲基化，從而恢復(fù)BRCA1表達(dá)，并抑制了多種癌細(xì)胞系的細(xì)胞生長(zhǎng)。同樣，Xu等人（2018年）使用與TET3CD耦合的高保真度dcas9去甲基化腎臟纖維化中的高甲基化抗纖維化基因，展示了體外和體內(nèi)抗纖維化基因Rasal1和Klotho的成功基因特異性重新激活。未來(lái)的研究方向，如優(yōu)化sgRNA結(jié)合位點(diǎn)相對(duì)于目標(biāo)的位置和研究脫靶效應(yīng)，將提高這種CRISPR/Cas9技術(shù)的廣度和實(shí)用性。TET也可以通過(guò)改變其底物和輔因子的可用性間接修飾。例如，α-酮戊二酸（α-KG）是三羧酸循環(huán)（TCA）中的關(guān)鍵中間體，也是TET在去甲基化途徑中的底物。Liu等人（2023年）的研究表明，α-KG補(bǔ)充增加了黑色素瘤中TET2/3的活性，導(dǎo)致PD-L1啟動(dòng)子處5hmC水平升高，提高了ICI的療效。異檸檬酸脫氫酶（IDH）基因IDH1和IDH2的突變也可能影響TET活性，因?yàn)橥蛔兠笇?alpha;-KG轉(zhuǎn)化為2-羥基戊二酸，這是TET催化位點(diǎn)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。然而，IDH突變是否是癌癥中5hmC耗竭的主要原因仍不確定。維生素C是另一種可以增強(qiáng)TET活性的輔因子，從而增加5hmC水平。Peng等人（2018年）證明，維生素C處理可以以時(shí)間和濃度依賴性的方式恢復(fù)5hmC水平，同時(shí)抑制膀胱和腎臟癌細(xì)胞系的細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)凋亡。盡管TET活性增加，但TET1/2/3的表達(dá)水平并沒有顯著變化，表明維生素C增強(qiáng)了TET活性，而不是表達(dá)水平。在其他癌癥中也觀察到了類似的發(fā)現(xiàn)，表明維生素C治療可能是癌癥的潛在選擇。 盡管α-KG和維生素C在改變TET活性方面顯示出潛力，但這些輔因子也參與多種細(xì)胞過(guò)程，因此可能導(dǎo)致意想不到的副作用。需要進(jìn)一步研究這些輔因子改變的確切機(jī)制和后果。
挑戰(zhàn)和未來(lái)方向
選擇正確的5hmC檢測(cè)方法
5hmC檢測(cè)方法進(jìn)步導(dǎo)致了研究羥甲基化組的全基因組分析策略的改進(jìn)。目前的技術(shù)現(xiàn)在可以區(qū)分各種胞嘧啶修飾（表1），從而可以單獨(dú)評(píng)估每種修飾在腫瘤發(fā)生中的作用。同時(shí)對(duì)基因組和表觀基因組進(jìn)行測(cè)序的新方法具有巨大的前景，為使用單一工作流程進(jìn)行多組學(xué)分析提供了機(jī)會(huì)。然而，DNA輸入要求和測(cè)序成本等挑戰(zhàn)依然存在。此外，隨著cfDNA輸入的使用不斷增長(zhǎng)，即使在低濃度下，也必須有能夠檢測(cè)5hmC的靈敏檢測(cè)方法。盡管如此，基于液體活檢技術(shù)的發(fā)展正在出現(xiàn)，可以提高cfDNA檢測(cè)的靈敏度和特異性。方法的選擇可能會(huì)受到分析解決這些障礙的程度或所選方法所需試劑的可用性的影響。
cfDNA羥甲基化的多組學(xué)分析
對(duì)癌癥檢測(cè)、預(yù)后和預(yù)測(cè)治療結(jié)果的cfDNA羥甲基化組進(jìn)行分析正在取得進(jìn)展。將5hmC數(shù)據(jù)與其他組學(xué)相結(jié)合，不僅可以補(bǔ)充當(dāng)前的生物標(biāo)志物模型，還可以更全面地了解癌癥生物學(xué)。然而，在臨床實(shí)施可行之前，需要解決幾個(gè)挑戰(zhàn)。
首先，每個(gè)血漿樣本中ctDNA含量有限（5-10ng/mL），這對(duì)多組學(xué)研究構(gòu)成挑戰(zhàn)，因?yàn)檫M(jìn)行多次檢測(cè)時(shí)ctDNA含量往往不足。
其次，多組學(xué)cfDNA研究的標(biāo)準(zhǔn)化方法仍然缺乏，因?yàn)檫@仍然是一個(gè)不斷發(fā)展的領(lǐng)域。開源生物信息學(xué)管道、ctDNA解卷積方法和合成參考對(duì)照（即DNA尖峰）的開發(fā)將有助于確保集成數(shù)據(jù)的可重復(fù)性和可比性。
第三，來(lái)自腫瘤微環(huán)境或外周血白細(xì)胞中cfDNA的表觀遺傳信號(hào)可能會(huì)破壞或稀釋正在研究的ctDNA信號(hào)。因此，至關(guān)重要的是要有適當(dāng)?shù)墓ぞ邅?lái)細(xì)化腫瘤特異性5hmC信號(hào)，同時(shí)濾除背景、非腫瘤噪聲。目前的工具包括calling ctDNA變體和過(guò)濾外周血白細(xì)胞信號(hào)。
最后，擁有適當(dāng)?shù)纳镄畔W(xué)工具和基礎(chǔ)設(shè)施對(duì)于支持新發(fā)現(xiàn)的整合和分析至關(guān)重要。
結(jié)論
DNA羥甲基化作為癌癥檢測(cè)、預(yù)后和治療反應(yīng)預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物具有巨大的前景。分析方法的進(jìn)展，特別是cfDNA方法的進(jìn)步，使人們能夠開發(fā)出高靈敏度和特異性的工具來(lái)檢測(cè)羥甲基化。通過(guò)將5hmC數(shù)據(jù)與其他多組學(xué)數(shù)據(jù)集整合，可以進(jìn)一步增強(qiáng)這些發(fā)展，提供對(duì)癌癥機(jī)制的更全面了解，并有助于發(fā)現(xiàn)新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，在更廣泛地臨床采用5hmC生物標(biāo)志物之前，仍有幾個(gè)挑戰(zhàn)需要解決。這些包括進(jìn)一步驗(yàn)證當(dāng)前的生物標(biāo)志物，解決測(cè)序和輸入相關(guān)的問(wèn)題，以及建立必要的生物信息學(xué)工具和分析基礎(chǔ)設(shè)施。盡管如此，隨著對(duì)5hmC機(jī)制和檢測(cè)方法的持續(xù)研究，5hmC有可能成為改善癌癥治療的有價(jià)值的生物標(biāo)志物。
參考文獻(xiàn)：
Li JJN, Liu G, Lok BH. Cell-Free DNA Hydroxymethylation in Cancer: Current and Emerging Detection Methods and Clinical Applications. Genes (Basel). 2024 Sep 3;15(9) pii: genes15091160. doi: 10.3390/genes15091160. PubMed PMID: 39336751.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
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