Nature文獻(xiàn)解讀：WGBS揭示最全正常人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型的綜合DNA甲基化圖譜
DNA甲基化是一種基本的表觀遺傳標(biāo)記，可以調(diào)控基因表達(dá)和染色質(zhì)組裝，從而為研究細(xì)胞身份和發(fā)育過(guò)程提供了重要視角。當(dāng)前已有的數(shù)據(jù)集通常只包括部分甲基化位點(diǎn)，并且常�；谠谂囵B(yǎng)過(guò)程中經(jīng)歷了巨大變化的細(xì)胞系，或者是基于包含未指定混合細(xì)胞的組織。
2023年，以色列耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)Tommy Kaplan等人基于深度全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）對(duì)來(lái)自205個(gè)健康組織樣本中分選的39種細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)千個(gè)獨(dú)特標(biāo)記進(jìn)行片段級(jí)分析，構(gòu)建了人類(lèi)DNA甲基化圖譜。研究發(fā)現(xiàn)，相同細(xì)胞類(lèi)型的重復(fù)樣本之間的相似性超過(guò)99.5%，顯示出細(xì)胞身份程序?qū)Νh(huán)境動(dòng)態(tài)變化的穩(wěn)健性（robustness）。相關(guān)研究成果以“A DNA methylation atlas of normal human cell types”為題發(fā)表在《自然》（Nature）期刊上。
題目：A DNA methylation atlas of normal human cell types
期刊：Nature
影響因子：50.5
技術(shù)平臺(tái)：WGBS
本研究通過(guò)WGBS對(duì)不同細(xì)胞類(lèi)型的DNA甲基化圖譜進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析，追溯到組織發(fā)育的關(guān)鍵因子，并鑒定出自胚胎發(fā)育起始的保守甲基化模式。研究揭示特定細(xì)胞類(lèi)型中特異性未甲基化位點(diǎn)通常位于轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子中，并包含組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合位點(diǎn)。特異性高甲基化位點(diǎn)則較為罕見(jiàn)，且富含CpG島、Polycomb靶點(diǎn)和CTCF結(jié)合位點(diǎn)，表明其在塑造細(xì)胞類(lèi)型特異性染色質(zhì)回路中可能發(fā)揮新作用。該圖譜為研究基因調(diào)控和與疾病相關(guān)的遺傳變異提供一個(gè)基本資源，并為液體活檢中使用的潛在組織特異性生物標(biāo)志物提供了大量可能性。
人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型的DNA甲基化圖譜
為了繪制不同細(xì)胞類(lèi)型中的全基因組DNA甲基化圖譜，研究人員對(duì)205個(gè)樣本（包括77種主要細(xì)胞類(lèi)型）進(jìn)行WGBS（平均深度至少為30×的150bp的配對(duì)末端測(cè)序）。所選樣本經(jīng)過(guò)仔細(xì)分選并比對(duì)到人類(lèi)參考基因組（hg19，hg38），通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、基因表達(dá)和DNA甲基化分析鑒定平均樣本純度（所需細(xì)胞類(lèi)型材料比例）超過(guò)90%。所分析的細(xì)胞類(lèi)型（圖1）代表了大多數(shù)主要的人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型，可以對(duì)生理系統(tǒng)（如胃腸道、造血細(xì)胞和胰腺）進(jìn)行綜合觀察，以及比較不同環(huán)境中的類(lèi)似細(xì)胞類(lèi)型（如組織駐留的巨噬細(xì)胞）。
圖1：成人人體的甲基化圖譜。
在18kb區(qū)域中顯示了344個(gè)CpG位點(diǎn)（列）上205個(gè)甲基化體（行）的DNA甲基化模式。突出顯示的是B細(xì)胞（藍(lán)色）、神經(jīng)元（綠色）、甲狀腺上皮（黃色）和神經(jīng)元/少突膠質(zhì)細(xì)胞（少突膠質(zhì)）（粉紅色）中未甲基化的區(qū)域。
205個(gè)甲基化圖譜在重復(fù)樣本中相似，而在不同細(xì)胞類(lèi)型之間則以區(qū)塊方式顯著變化。研究人員在特定細(xì)胞類(lèi)型中鑒定差異甲基化區(qū)域，以揭示細(xì)胞類(lèi)型特異性的生物過(guò)程，定義細(xì)胞身份，并促進(jìn)甲基化生物標(biāo)志物的發(fā)展，以鑒定循環(huán)cfDNA片段的細(xì)胞起源。
研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)名為wgbstools的計(jì)算機(jī)器學(xué)習(xí)套件，用于分析WGBS數(shù)據(jù)，通過(guò)鑒定多個(gè)條件下DNA甲基化模式的變化點(diǎn)，將基因組切割成7104162個(gè)不重疊連續(xù)區(qū)塊。每個(gè)區(qū)塊跨越高度相關(guān)的CpG位點(diǎn)，在每個(gè)樣本中甲基化程度相似，保留至少包含三個(gè)CpG位點(diǎn)的2783421個(gè)甲基化塊（平均長(zhǎng)度為544 bp），以及8個(gè)CpG位點(diǎn)。對(duì)這些緊湊的基因組進(jìn)行穩(wěn)健分析比單獨(dú)CpG位點(diǎn)更為直接，并且由于甲基化的區(qū)域性質(zhì)，可以被視為人類(lèi)DNA甲基化的生物學(xué)“原子”。
甲基化記錄發(fā)展歷程
DNA甲基化模式不僅可以反映細(xì)胞的功能身份，還可以追溯其發(fā)展歷程。為了鑒定早期祖先后代共有模式，研究人員計(jì)算了至少包含四個(gè)CpG位點(diǎn)的區(qū)塊平均甲基化水平，并選擇樣本中的最高變異性區(qū)塊（21000個(gè)區(qū)塊，前1%）。使用無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析對(duì)所有205個(gè)甲基化圖譜進(jìn)行聚類(lèi)，系統(tǒng)地將相同細(xì)胞類(lèi)型的生物學(xué)樣本分組（圖2），類(lèi)似于純化的人血細(xì)胞基于陣列的聚類(lèi)。支持了細(xì)胞分離的可重復(fù)性，并表明每個(gè)正常細(xì)胞類(lèi)型的三~四個(gè)重復(fù)足以檢測(cè)其甲基化模式，可用于生物標(biāo)志物鑒定等實(shí)際應(yīng)用中。
圖2：無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)揭示健康細(xì)胞類(lèi)型的人類(lèi)發(fā)育譜系。
細(xì)胞類(lèi)型特異性甲基化標(biāo)志物
接下來(lái)研究以細(xì)胞類(lèi)型特異性方式差異甲基化的基因組區(qū)域，作者將205個(gè)樣本分為39種特定細(xì)胞類(lèi)型，每種細(xì)胞類(lèi)型的前25個(gè)差異性未甲基化區(qū)域構(gòu)成了一個(gè)包含1246個(gè)標(biāo)記的人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型特異性甲基化圖譜（圖3）。這些區(qū)域在特定細(xì)胞類(lèi)型中表現(xiàn)出特異性未甲基化（平均甲基化水平為13%），而在所有其他樣本甲基化（平均甲基化水平為91%），可以作為敏感的生物標(biāo)志物，用于定量混合物中特定細(xì)胞類(lèi)型。這些標(biāo)記包括953個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性未甲基化位點(diǎn)，以及另外293個(gè)在少數(shù)相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型中未甲基化的位點(diǎn)。
圖3：39種細(xì)胞類(lèi)型共205個(gè)樣本的人類(lèi)甲基化圖譜。
a. 總共有953個(gè)基因組區(qū)域以細(xì)胞類(lèi)型特異性方式未甲基化。圖中的每個(gè)單元格標(biāo)記了39個(gè)細(xì)胞類(lèi)型（行）中每個(gè)基因組區(qū)域（列）的平均甲基化水平。每個(gè)細(xì)胞類(lèi)型顯示多達(dá)25個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域的平均長(zhǎng)度為356 bp（9個(gè)CpG位點(diǎn)）。
b. 心肌細(xì)胞的前25個(gè)區(qū)域。每個(gè)區(qū)域繪制了圖譜中所有29種細(xì)胞類(lèi)型205個(gè)樣本中每個(gè)CpG位點(diǎn)（列）的平均甲基化水平。
c. 心肌細(xì)胞特異性未甲基化位點(diǎn)。淺藍(lán)色高亮標(biāo)記為120 bp（6個(gè)CpG位點(diǎn)），位于MYL4基因的第一個(gè)內(nèi)含子中，MYL4是一個(gè)心臟特異性基因（心房附屬物TPM表達(dá)量為2518）�；蚪M快照顯示六個(gè)心肌細(xì)胞樣本、四個(gè)心臟成纖維細(xì)胞樣本和三個(gè)主動(dòng)脈樣本（兩個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞和一個(gè)平滑肌細(xì)胞）的平均甲基化水平（紫色軌跡）。
d. 三個(gè)心肌細(xì)胞樣本、一個(gè)心臟成纖維細(xì)胞樣本和兩個(gè)主動(dòng)脈樣本（內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化片段可視化。黃色和藍(lán)色點(diǎn)分別表示甲基化和未甲基化的CpG位點(diǎn)。
人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型特異性調(diào)控圖
接下來(lái)，研究人員表征這些細(xì)胞類(lèi)型特異性差異未甲基化區(qū)域。分別利用轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序（ATAC-seq）、DNase I超敏位點(diǎn)測(cè)序（DNaseI-seq）分析細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記的DNA可及性和染色質(zhì)狀態(tài)。分析結(jié)果表明，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中前250個(gè)未甲基化標(biāo)記高度可及，并且以單核細(xì)胞中的H3K27ac和H3K4me1為特征，而其他細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)記在單核細(xì)胞中沒(méi)有富集，同時(shí)還揭示了細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記chromHMM增強(qiáng)子注釋的強(qiáng)烈協(xié)調(diào)富集（圖4a）。這些發(fā)現(xiàn)與之前將組織特異性去甲基化與基因增強(qiáng)子聯(lián)系起來(lái)的研究一致。
為進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞類(lèi)型特異性未甲基化區(qū)域的生物學(xué)重要性，作者研究了它們與轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的關(guān)聯(lián)。使用每種細(xì)胞類(lèi)型前1000個(gè)未甲基化標(biāo)記進(jìn)行motif分析，計(jì)算這些標(biāo)記所富集的TF結(jié)合motif，研究結(jié)果表明對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型，Top motifs包括主調(diào)控因子和關(guān)鍵TFs（圖4b）。例如，B細(xì)胞富含Ebf2/HEB/E2A，粒細(xì)胞富含CEBP/AP1/ETS，T細(xì)胞富含ETS/RUNX。細(xì)胞類(lèi)型特異性未甲基化區(qū)域與TF結(jié)合motif之間的關(guān)聯(lián)可以鑒定新的基因調(diào)控回路，并暴露在特定細(xì)胞類(lèi)型中活躍的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子。
b. 細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記調(diào)控motif的富集。顯示每個(gè)細(xì)胞類(lèi)型中前1000個(gè)差異性未甲基化區(qū)域富集的top轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)motif。
細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化位點(diǎn)
作者研究了在一種細(xì)胞類(lèi)型中甲基化而在人體其他部位未甲基化的基因組區(qū)域（即特異性高甲基化區(qū)域），這些區(qū)域富含CpG島且在其他細(xì)胞類(lèi)型中被H3K27me3和Polycomb標(biāo)記（圖5a-c）。
在綜合分析所有細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化區(qū)域后，結(jié)果揭示特異性高甲基化區(qū)域?qū)θ旧|(zhì)調(diào)節(jié)因子CTCF的靶向序列強(qiáng)富集（圖5d），表明CTCF結(jié)合位點(diǎn)的DNA甲基化可能作為組織特異性調(diào)控開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)控其結(jié)合，可能影響組織特異性的三維基因組。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者比較了CTCF位點(diǎn)的DNA甲基化模式與特定組織中全基因組CTCF蛋白結(jié)合模式（圖5e），結(jié)果顯示在結(jié)腸和腸道特異性甲基化位點(diǎn)的甲基化模式和已發(fā)表的體內(nèi)CTCF占有情況。與DNA甲基化抑制CTCF結(jié)合一致，ChIP數(shù)據(jù)顯示結(jié)腸中這個(gè)位點(diǎn)CTCF結(jié)合的選擇性丟失。此外，在特定細(xì)胞類(lèi)型中甲基化位點(diǎn)富集了神經(jīng)基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子RE1-沉默TF/神經(jīng)元限制性沉默因子（REST/NRSF）的靶標(biāo)，且在胰島細(xì)胞的甲基組中最突出（圖5f）。
b. 這些區(qū)域通常在其他細(xì)胞類(lèi)型中富含H3K27me3。
c. 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的Polycomb注釋?zhuān)╟hromHMM），包括所有或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記。
d. 細(xì)胞類(lèi)型中前100個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化區(qū)域的motif分析鑒定出已知CTCF和REST/NRSF motif。
e. 對(duì)hg19位點(diǎn)（chr. 1: 209364093–209364250）的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析，該位點(diǎn)在小腸和結(jié)腸上皮中特異甲基化（紅框1），在其他地方未甲基化。
f. 在內(nèi)分泌胰腺中，前100個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化區(qū)域中有14%存在REST/NRSF motif，頂級(jí)delta細(xì)胞標(biāo)記中有7%，頂級(jí)alpha細(xì)胞標(biāo)記中有2%，與背景序列中大約0.1%相比，這與內(nèi)分泌胰腺中REST靶標(biāo)表達(dá)一致。
片段級(jí)甲基化組反卷積
圖6：使用細(xì)胞類(lèi)型特異性生物標(biāo)志物的片段級(jí)反卷積。
易小結(jié)：
本研究通過(guò)WGBS繪制了人類(lèi)原代細(xì)胞類(lèi)型的全面DNA甲基化圖譜，篩選出一套廣泛的細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記，并開(kāi)發(fā)出一套用于混合細(xì)胞類(lèi)型樣本片段級(jí)分析的計(jì)算工具。這些工具的開(kāi)發(fā)補(bǔ)充了現(xiàn)有的大量基于芯片陣列甲基化圖譜和去卷積工具，也可用于分析陣列數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)共同揭示了DNA甲基化在細(xì)胞生物學(xué)和基因調(diào)控中的作用，并促進(jìn)了在每種細(xì)胞類(lèi)型中活躍的增強(qiáng)子的鑒定。本研究的圖譜最有前景的用途可能是混合細(xì)胞類(lèi)型樣本的片段級(jí)去卷積，允許在癌癥和其他疾病患者的血漿中高靈敏度的鑒定cfDNA的起源組織。
參考文獻(xiàn)：
Loyfer N, et al. A DNA methylation atlas of normal human cell types. Nature. 2023 Jan;613(7943):355-364. pii: 10.1038/s41586-022-05580-6. doi: 10.1038/s41586-022-05580-6. PubMed PMID: 36599988.
2023年，以色列耶路撒冷希伯來(lái)大學(xué)Tommy Kaplan等人基于深度全基因組亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS）對(duì)來(lái)自205個(gè)健康組織樣本中分選的39種細(xì)胞類(lèi)型的數(shù)千個(gè)獨(dú)特標(biāo)記進(jìn)行片段級(jí)分析，構(gòu)建了人類(lèi)DNA甲基化圖譜。研究發(fā)現(xiàn)，相同細(xì)胞類(lèi)型的重復(fù)樣本之間的相似性超過(guò)99.5%，顯示出細(xì)胞身份程序?qū)Νh(huán)境動(dòng)態(tài)變化的穩(wěn)健性（robustness）。相關(guān)研究成果以“A DNA methylation atlas of normal human cell types”為題發(fā)表在《自然》（Nature）期刊上。
題目：A DNA methylation atlas of normal human cell types
期刊：Nature
影響因子：50.5
技術(shù)平臺(tái)：WGBS
本研究通過(guò)WGBS對(duì)不同細(xì)胞類(lèi)型的DNA甲基化圖譜進(jìn)行無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析，追溯到組織發(fā)育的關(guān)鍵因子，并鑒定出自胚胎發(fā)育起始的保守甲基化模式。研究揭示特定細(xì)胞類(lèi)型中特異性未甲基化位點(diǎn)通常位于轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子中，并包含組織特異性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的DNA結(jié)合位點(diǎn)。特異性高甲基化位點(diǎn)則較為罕見(jiàn)，且富含CpG島、Polycomb靶點(diǎn)和CTCF結(jié)合位點(diǎn)，表明其在塑造細(xì)胞類(lèi)型特異性染色質(zhì)回路中可能發(fā)揮新作用。該圖譜為研究基因調(diào)控和與疾病相關(guān)的遺傳變異提供一個(gè)基本資源，并為液體活檢中使用的潛在組織特異性生物標(biāo)志物提供了大量可能性。
人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型的DNA甲基化圖譜
為了繪制不同細(xì)胞類(lèi)型中的全基因組DNA甲基化圖譜，研究人員對(duì)205個(gè)樣本（包括77種主要細(xì)胞類(lèi)型）進(jìn)行WGBS（平均深度至少為30×的150bp的配對(duì)末端測(cè)序）。所選樣本經(jīng)過(guò)仔細(xì)分選并比對(duì)到人類(lèi)參考基因組（hg19，hg38），通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)、基因表達(dá)和DNA甲基化分析鑒定平均樣本純度（所需細(xì)胞類(lèi)型材料比例）超過(guò)90%。所分析的細(xì)胞類(lèi)型（圖1）代表了大多數(shù)主要的人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型，可以對(duì)生理系統(tǒng)（如胃腸道、造血細(xì)胞和胰腺）進(jìn)行綜合觀察，以及比較不同環(huán)境中的類(lèi)似細(xì)胞類(lèi)型（如組織駐留的巨噬細(xì)胞）。
圖1：成人人體的甲基化圖譜。
205個(gè)甲基化圖譜在重復(fù)樣本中相似，而在不同細(xì)胞類(lèi)型之間則以區(qū)塊方式顯著變化。研究人員在特定細(xì)胞類(lèi)型中鑒定差異甲基化區(qū)域，以揭示細(xì)胞類(lèi)型特異性的生物過(guò)程，定義細(xì)胞身份，并促進(jìn)甲基化生物標(biāo)志物的發(fā)展，以鑒定循環(huán)cfDNA片段的細(xì)胞起源。
研究人員開(kāi)發(fā)了一個(gè)名為wgbstools的計(jì)算機(jī)器學(xué)習(xí)套件，用于分析WGBS數(shù)據(jù)，通過(guò)鑒定多個(gè)條件下DNA甲基化模式的變化點(diǎn)，將基因組切割成7104162個(gè)不重疊連續(xù)區(qū)塊。每個(gè)區(qū)塊跨越高度相關(guān)的CpG位點(diǎn)，在每個(gè)樣本中甲基化程度相似，保留至少包含三個(gè)CpG位點(diǎn)的2783421個(gè)甲基化塊（平均長(zhǎng)度為544 bp），以及8個(gè)CpG位點(diǎn)。對(duì)這些緊湊的基因組進(jìn)行穩(wěn)健分析比單獨(dú)CpG位點(diǎn)更為直接，并且由于甲基化的區(qū)域性質(zhì)，可以被視為人類(lèi)DNA甲基化的生物學(xué)“原子”。
甲基化記錄發(fā)展歷程
DNA甲基化模式不僅可以反映細(xì)胞的功能身份，還可以追溯其發(fā)展歷程。為了鑒定早期祖先后代共有模式，研究人員計(jì)算了至少包含四個(gè)CpG位點(diǎn)的區(qū)塊平均甲基化水平，并選擇樣本中的最高變異性區(qū)塊（21000個(gè)區(qū)塊，前1%）。使用無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)分析對(duì)所有205個(gè)甲基化圖譜進(jìn)行聚類(lèi)，系統(tǒng)地將相同細(xì)胞類(lèi)型的生物學(xué)樣本分組（圖2），類(lèi)似于純化的人血細(xì)胞基于陣列的聚類(lèi)。支持了細(xì)胞分離的可重復(fù)性，并表明每個(gè)正常細(xì)胞類(lèi)型的三~四個(gè)重復(fù)足以檢測(cè)其甲基化模式，可用于生物標(biāo)志物鑒定等實(shí)際應(yīng)用中。
圖2：無(wú)監(jiān)督聚類(lèi)揭示健康細(xì)胞類(lèi)型的人類(lèi)發(fā)育譜系。
細(xì)胞類(lèi)型特異性甲基化標(biāo)志物
接下來(lái)研究以細(xì)胞類(lèi)型特異性方式差異甲基化的基因組區(qū)域，作者將205個(gè)樣本分為39種特定細(xì)胞類(lèi)型，每種細(xì)胞類(lèi)型的前25個(gè)差異性未甲基化區(qū)域構(gòu)成了一個(gè)包含1246個(gè)標(biāo)記的人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型特異性甲基化圖譜（圖3）。這些區(qū)域在特定細(xì)胞類(lèi)型中表現(xiàn)出特異性未甲基化（平均甲基化水平為13%），而在所有其他樣本甲基化（平均甲基化水平為91%），可以作為敏感的生物標(biāo)志物，用于定量混合物中特定細(xì)胞類(lèi)型。這些標(biāo)記包括953個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性未甲基化位點(diǎn)，以及另外293個(gè)在少數(shù)相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型中未甲基化的位點(diǎn)。
圖3：39種細(xì)胞類(lèi)型共205個(gè)樣本的人類(lèi)甲基化圖譜。
b. 心肌細(xì)胞的前25個(gè)區(qū)域。每個(gè)區(qū)域繪制了圖譜中所有29種細(xì)胞類(lèi)型205個(gè)樣本中每個(gè)CpG位點(diǎn)（列）的平均甲基化水平。
c. 心肌細(xì)胞特異性未甲基化位點(diǎn)。淺藍(lán)色高亮標(biāo)記為120 bp（6個(gè)CpG位點(diǎn)），位于MYL4基因的第一個(gè)內(nèi)含子中，MYL4是一個(gè)心臟特異性基因（心房附屬物TPM表達(dá)量為2518）�；蚪M快照顯示六個(gè)心肌細(xì)胞樣本、四個(gè)心臟成纖維細(xì)胞樣本和三個(gè)主動(dòng)脈樣本（兩個(gè)內(nèi)皮細(xì)胞和一個(gè)平滑肌細(xì)胞）的平均甲基化水平（紫色軌跡）。
d. 三個(gè)心肌細(xì)胞樣本、一個(gè)心臟成纖維細(xì)胞樣本和兩個(gè)主動(dòng)脈樣本（內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞）的亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化片段可視化。黃色和藍(lán)色點(diǎn)分別表示甲基化和未甲基化的CpG位點(diǎn)。
人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型特異性調(diào)控圖
接下來(lái)，研究人員表征這些細(xì)胞類(lèi)型特異性差異未甲基化區(qū)域。分別利用轉(zhuǎn)座酶可及染色質(zhì)測(cè)序（ATAC-seq）、DNase I超敏位點(diǎn)測(cè)序（DNaseI-seq）分析細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記的DNA可及性和染色質(zhì)狀態(tài)。分析結(jié)果表明，單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中前250個(gè)未甲基化標(biāo)記高度可及，并且以單核細(xì)胞中的H3K27ac和H3K4me1為特征，而其他細(xì)胞類(lèi)型標(biāo)記在單核細(xì)胞中沒(méi)有富集，同時(shí)還揭示了細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記chromHMM增強(qiáng)子注釋的強(qiáng)烈協(xié)調(diào)富集（圖4a）。這些發(fā)現(xiàn)與之前將組織特異性去甲基化與基因增強(qiáng)子聯(lián)系起來(lái)的研究一致。
為進(jìn)一步評(píng)估細(xì)胞類(lèi)型特異性未甲基化區(qū)域的生物學(xué)重要性，作者研究了它們與轉(zhuǎn)錄因子（TFs）的關(guān)聯(lián)。使用每種細(xì)胞類(lèi)型前1000個(gè)未甲基化標(biāo)記進(jìn)行motif分析，計(jì)算這些標(biāo)記所富集的TF結(jié)合motif，研究結(jié)果表明對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型，Top motifs包括主調(diào)控因子和關(guān)鍵TFs（圖4b）。例如，B細(xì)胞富含Ebf2/HEB/E2A，粒細(xì)胞富含CEBP/AP1/ETS，T細(xì)胞富含ETS/RUNX。細(xì)胞類(lèi)型特異性未甲基化區(qū)域與TF結(jié)合motif之間的關(guān)聯(lián)可以鑒定新的基因調(diào)控回路，并暴露在特定細(xì)胞類(lèi)型中活躍的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子。
圖4：作為潛在增強(qiáng)子的細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記。
a. 單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的前250個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性未甲基化標(biāo)記，顯示了活性調(diào)控標(biāo)記H3K27ac、增強(qiáng)子標(biāo)記H3K4me1、DNA可及性和chromHMM增強(qiáng)子注釋的平均ChIP-seq信號(hào)。作為比較，其他血細(xì)胞類(lèi)型（粒細(xì)胞和B、T及NK細(xì)胞）的前250個(gè)標(biāo)記的平均信號(hào)以灰色線條顯示。b. 細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記調(diào)控motif的富集。顯示每個(gè)細(xì)胞類(lèi)型中前1000個(gè)差異性未甲基化區(qū)域富集的top轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)motif。
細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化位點(diǎn)
作者研究了在一種細(xì)胞類(lèi)型中甲基化而在人體其他部位未甲基化的基因組區(qū)域（即特異性高甲基化區(qū)域），這些區(qū)域富含CpG島且在其他細(xì)胞類(lèi)型中被H3K27me3和Polycomb標(biāo)記（圖5a-c）。
在綜合分析所有細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化區(qū)域后，結(jié)果揭示特異性高甲基化區(qū)域?qū)θ旧|(zhì)調(diào)節(jié)因子CTCF的靶向序列強(qiáng)富集（圖5d），表明CTCF結(jié)合位點(diǎn)的DNA甲基化可能作為組織特異性調(diào)控開(kāi)關(guān)來(lái)調(diào)控其結(jié)合，可能影響組織特異性的三維基因組。為了驗(yàn)證這一假設(shè)，作者比較了CTCF位點(diǎn)的DNA甲基化模式與特定組織中全基因組CTCF蛋白結(jié)合模式（圖5e），結(jié)果顯示在結(jié)腸和腸道特異性甲基化位點(diǎn)的甲基化模式和已發(fā)表的體內(nèi)CTCF占有情況。與DNA甲基化抑制CTCF結(jié)合一致，ChIP數(shù)據(jù)顯示結(jié)腸中這個(gè)位點(diǎn)CTCF結(jié)合的選擇性丟失。此外，在特定細(xì)胞類(lèi)型中甲基化位點(diǎn)富集了神經(jīng)基因的轉(zhuǎn)錄抑制因子RE1-沉默TF/神經(jīng)元限制性沉默因子（REST/NRSF）的靶標(biāo)，且在胰島細(xì)胞的甲基組中最突出（圖5f）。
圖5：細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化區(qū)域富集于CpG島、Polycomb靶點(diǎn)以及CTCF和REST/NRSF。
a. Top細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化標(biāo)記中有38%（3,613個(gè)中的1363個(gè)）與CpG島重疊。b. 這些區(qū)域通常在其他細(xì)胞類(lèi)型中富含H3K27me3。
c. 單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中的Polycomb注釋?zhuān)╟hromHMM），包括所有或單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性標(biāo)記。
d. 細(xì)胞類(lèi)型中前100個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化區(qū)域的motif分析鑒定出已知CTCF和REST/NRSF motif。
e. 對(duì)hg19位點(diǎn)（chr. 1: 209364093–209364250）的ChIP-seq數(shù)據(jù)分析，該位點(diǎn)在小腸和結(jié)腸上皮中特異甲基化（紅框1），在其他地方未甲基化。
f. 在內(nèi)分泌胰腺中，前100個(gè)細(xì)胞類(lèi)型特異性高甲基化區(qū)域中有14%存在REST/NRSF motif，頂級(jí)delta細(xì)胞標(biāo)記中有7%，頂級(jí)alpha細(xì)胞標(biāo)記中有2%，與背景序列中大約0.1%相比，這與內(nèi)分泌胰腺中REST靶標(biāo)表達(dá)一致。
片段級(jí)甲基化組反卷積
圖6：使用細(xì)胞類(lèi)型特異性生物標(biāo)志物的片段級(jí)反卷積。
易小結(jié)：
本研究通過(guò)WGBS繪制了人類(lèi)原代細(xì)胞類(lèi)型的全面DNA甲基化圖譜，篩選出一套廣泛的細(xì)胞類(lèi)型特異性標(biāo)記，并開(kāi)發(fā)出一套用于混合細(xì)胞類(lèi)型樣本片段級(jí)分析的計(jì)算工具。這些工具的開(kāi)發(fā)補(bǔ)充了現(xiàn)有的大量基于芯片陣列甲基化圖譜和去卷積工具，也可用于分析陣列數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)共同揭示了DNA甲基化在細(xì)胞生物學(xué)和基因調(diào)控中的作用，并促進(jìn)了在每種細(xì)胞類(lèi)型中活躍的增強(qiáng)子的鑒定。本研究的圖譜最有前景的用途可能是混合細(xì)胞類(lèi)型樣本的片段級(jí)去卷積，允許在癌癥和其他疾病患者的血漿中高靈敏度的鑒定cfDNA的起源組織。
參考文獻(xiàn)：
Loyfer N, et al. A DNA methylation atlas of normal human cell types. Nature. 2023 Jan;613(7943):355-364. pii: 10.1038/s41586-022-05580-6. doi: 10.1038/s41586-022-05580-6. PubMed PMID: 36599988.
標(biāo)簽：
DNA甲基化
- Nature文獻(xiàn)解讀：WGBS揭示最全正常人類(lèi)細(xì)胞類(lèi)型的綜合DNA甲基化圖譜
- 文獻(xiàn)解讀：表觀基因組-微生物組軸揭示腸道菌群的宿主調(diào)控
- RNA-BS揭示動(dòng)物不同發(fā)育階段的mRNA m5C甲基化圖譜和調(diào)控機(jī)制
- 單細(xì)胞空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析揭示與胰腺癌預(yù)后不良相關(guān)的中間態(tài)癌細(xì)胞群
- 空間轉(zhuǎn)錄組系列十月高分文獻(xiàn)速遞
- 卵巢發(fā)育和衰老的m6A 甲基化揭示RNA穩(wěn)定性和染色質(zhì)狀態(tài)調(diào)控
- SSR分子標(biāo)記檢測(cè)服務(wù)的核心優(yōu)勢(shì)及應(yīng)用
- 恒河猴大腦高分辨率解剖區(qū)域的轉(zhuǎn)錄組和開(kāi)放染色質(zhì)圖譜
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