RNA干擾服務 天津賽爾生物

siRNA干擾
天津賽爾生物的siRNA干擾服務由參與主編《RNA干擾：原理與應用》的工作人員，可以根據(jù)客戶的需求，提供從siRNA設計到合成，shRNA質粒的構建，轉染，病毒包裝siRNA，RT-PCR及WB驗證的一站式服務，讓RNA干擾不再干擾您的科研。 技術背景： RNA干擾（RNA interfering，RNAi）現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA引發(fā)的廣泛存在于生物體內的序列特異性基因轉錄后的沉默過程。由于RNAi具有高度的序列專一性和有效的干擾，可以特異地將特定的基因沉默，從而獲得基因功能喪失或基因表達量的降低，因此可以作為功能基因組學的一種強有力的研究工具。RNAi技術可廣泛應用到包括功能學，藥物靶點篩選，細胞信號傳導通路分析，疾病治療等等。 2：基于化學合成的雙鏈siRNA，基于載體的shRNA構建，病毒系統(tǒng)包括慢病毒( lentiviral ) 、逆轉錄病毒( retroviral ) 和腺病毒 ( adenoviral ) 包裝siRNA 3：體外通過轉染或感染的方式導入siRNA 4：RT-PCR，WB檢測干擾效果 　 交付內容 1：siRNA序列 2：采用質粒轉染方式的，交付構建好的shRNA質粒。采用病毒系統(tǒng)包裝siRNA的，交付含有包裝shRNA序列的重組病毒。 3：RT-PCR，WB檢測結果。賽爾承諾，對于一些非公開siRNA序列基因的siRNA設計的干擾效果，三條序列中至少有一條干擾效果在75%以上 4：詳盡的操作步驟及實驗結果 常見問題及解答 問1：怎樣設計siRNA序列？ 答 siRNA序列的設計一般遵照以下的步驟和原則 1． 在所選基因的啟動子后 50-100個堿基自5’-端開始 2． 尋找基因序列中的23個堿基， 最好是5‘- AA（N19）TT -3’ （N是任何堿基） 3． 如果找不到四個以上AA（N19）TT，則用 AA（N21）補足。 4． 如果找不到四個以上AA（N21）， 則用 NA（N21）補足。 5． 所選定序列中，G和C的數(shù)目的總和在總數(shù)（23）的35-55%. 6． 滿足以上1-5項要求的片段數(shù)目如果不足四個，將G和C的數(shù)目的總和放寬至總數(shù)（23）的30-70%. 7． 選好上述序列后，以此確定所需合成雙鏈RNA oligo 的序列如下： 8． 正義序列 （N19）TT 與上述選定的23 個堿基序列中的第3-23個堿基相同 9． 反義序列的3’----5’ 的序列與目標序列中的第1-21個堿基互補， 即A變成T，C變成G， T變成A， G變成C。 10． 將反義序列3’----5’ 改寫成 5’----3’. 11． 將最后所得序列中除3’- 末端的兩個堿基之外的所有堿基中的T都用U來替代。 最后每三個組成一個字節(jié)，中間斷開。 12． 將所選定的正義序列和反義序列與gene bank 中已知同物種的基因序列進行比較，確定其唯一性（BLAST） 13． 上述 7-10 項可見如下例子： 假如通過1-5 項的條件選出的一段23 個堿基的序列是 5’- AAGCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 正義序列就應該是： 5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 反義序列就應該是: 3’- TTCGATCAGTACCGGTAACTG -5’ 反轉處理后即得： 正義序列： 5’- GCTAGTCATGGCCATTGACTT - 3’ 反義序列： 5’- GTCAATGGCCATGACTAGCTT -3’ U替代T以后得到： 正義序列： 5’- GCUAGUCAUGGCCAUUGACTT - 3’ 反義序列： 5’- GUCAAUGGCCAUGACUAGCTT -3’ 段開字節(jié)后最后得到： 正義序列： 5’- GCU AGU CAU GGC CAU UGA CTT - 3’ 反義序列： 5’- GUC AAU GGC CAU GAC UAG CTT -3’ 賽爾的siRNA專家曾經參與編寫《RNA干擾：原理與應用》，在siRNA設計方面非常有經驗，成功的為客戶設計了數(shù)百條siRNA序列。 　 問2：化學合成siRNA,編碼shRNA載體構建生產siRNA，重組病毒導入siRNA, 我該采用哪種方法進行RNA干擾？ 答：化學合成siRNA：操作簡便，研究人員得到合成好的siRNA后，進行簡單的稀釋處理即可實驗，但是基因抑制持續(xù)時間短，對細胞毒性較大。 編碼shRNA載體構建生產siRNA：與化學合成siRNA相比：shRNA載體能夠更有效阻遏相應基因的表達，可以用于穩(wěn)定細胞系的建立，可以持續(xù)提供siRNA，攜帶GFP的載體可以用于檢測轉染效率。操作相對復雜，需要構建shRNA質粒。 重組病毒包裝siRNA: 實驗操作相對復雜，對技術要求較高，費用較高，特別適合于一些難轉染的細胞系（如原代細胞，干細胞）的siRNA干擾。 所以客戶要綜合本實驗的要求，成本等各個方面選擇適合自己實驗的RNA干擾方法。 　 問3：為什么我采用國外文獻已經公布并且確定的siRNA序列，通過脂質體轉染的方法在我的細胞系中沒有得到預期的干擾效果？ 答： 國外文獻已經公布并且確定的siRNA序列從序列本身來說應該沒有問題，可能的情況是您的細胞系是否適用于常規(guī)的轉染方法，對于轉染效率低于50%的細胞系，我們建議采用重組病毒包裝siRNA的方法。所以您首先要通過查閱文獻或做一個GFP的對照實驗檢測一下您細胞的轉染效率。 　 問4：在轉染過程中發(fā)現(xiàn)細胞死亡，應該怎么處理？ 答： 常規(guī)的脂質體轉染試劑都會對細胞有一定的毒性，這不用奇怪。按照我們的經驗，如果細胞的死亡在30%以下，應該算是正常的。如果細胞的死亡大于60%，在排除其他操作的情況下，您就需要對轉染條件進行優(yōu)化，優(yōu)化的過程一般包括以下幾個方面： 1. 調整轉染試劑的濃度； 2. 在轉染后適當?shù)臅r間內更換無轉染試劑的培養(yǎng)液， 3.調整細胞的生長狀態(tài)；一般處于良好生長狀態(tài)的細胞對轉染試劑就有更好的耐受性； 4.調整轉染試劑和siRNA的比例 賽爾生物相關服務 MicroRNA siRNA干擾 課題整體外包服務 基因克隆服務 慢病毒包裝服務 腺病毒服務 穩(wěn)定細胞株篩選服務 蛋白表達服務 抗體制備服務 DNA與蛋白相互作用研究 噬菌體展示技術服務 cDNA文庫構建 干細胞研究 基金申請，標書撰寫，專利申請，課題設計等。

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