piRNA芯片技術(shù)服務(wù)

 piRNA芯片技術(shù)服務(wù)

    piRNA（Piwi-interacting RNA）是從哺乳動物生殖細(xì)胞中分離得到的一類非編碼小RNA，這類小RNA可與Piwi（P-element Induced Wimpy Testis）蛋白家族成員相互作用。Piwi蛋白家族包括在果蠅上表達(dá)的Piwi、 Aubergine 和AGO3蛋白，在小鼠上表達(dá)的MILI、MIWI 和 MIWI2蛋白，以及在人上表達(dá)的HILI、 HIWI1、 HIWI2和HIWI3蛋白[1]。雖然piRNA的生物起源和功能還未完全闡明，越來越多的證據(jù)表明piRNA對生殖細(xì)胞的發(fā)育非常關(guān)鍵。

 

   成熟的piRNA是一類長約26-32nt的單鏈小RNA分子。在小鼠睪丸內(nèi)只存在幾百種不同的miRNA，而piRNA卻至少有5萬種[2]。piRNA即使在近緣物種之間保守性也很差，在長度、表達(dá)類型和基因結(jié)構(gòu)上則與microRNA截然不同。

 

piRNA的生物起源

    與siRNA和miRNA的產(chǎn)生機(jī)制不同，piRNA并不產(chǎn)生于dsRNA前體。它似乎來自成簇piRNA的初始轉(zhuǎn)錄物，隨后再形成成熟的piRNA，此過程的詳細(xì)機(jī)制目前尚不清楚。然而從果蠅中的研究發(fā)現(xiàn)，與Aub或者Piwi相互結(jié)合的piRNA的前十個核苷酸（一般首個核苷酸是尿苷），可以和與Ago3結(jié)合的piRNA的前十個核苷酸（一般在10位的是腺苷）互補(bǔ)。由此提出了piRNA形成的“乒乓”模型，即由于piRNA之間序列互補(bǔ)，因此互為引物進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生新的piRNA[3]。

圖1  piRNA生物起源的“乒乓”模型。piRNA之間的序列互補(bǔ)引起piRNA分子的擴(kuò)增[3]。

 

piRNA的功能

     在精母細(xì)胞發(fā)育過程中，不同減數(shù)分裂期表達(dá)的piRNA不同，由此可將哺乳類piRNA分為前粗線期piRNA和粗線期piRNA。根據(jù)序列特征的不同，推測它們可能具有不同的功能[1]。

圖2  與小鼠體內(nèi)Piwi蛋白家族成員比如Mili和Miwi相關(guān)聯(lián)的piRNA可以分為具有不同功能的兩類[4]。

 

大量的證據(jù)表明，piRNA在精子形成中有不可或缺的作用。

   •  精子形成： 在精子形成過程中，Mili和Miwi蛋白的完全缺失會導(dǎo)致減數(shù)分裂停滯，造成細(xì)精管中無精子產(chǎn)生。

   •  翻譯調(diào)控：在精子形成所需蛋白的合成過程中，Miwi和piRNA與帽結(jié)合復(fù)合體聯(lián)結(jié)，調(diào)控mRNA的穩(wěn)定性[5]。

   •  基因組完整性的保存：Mili和Miwi雙敲除小鼠體內(nèi)逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子活性增加，表明piRNA可以保護(hù)精子基因組免受轉(zhuǎn)座子插入的危害[6]。

 

 展望

     距離多個物種piRNA的發(fā)現(xiàn)已經(jīng)過去了八年，但是我們對于新piRNA響應(yīng)如何起始以及發(fā)育過程中piRNA的準(zhǔn)確功能仍不清楚，還有許多開放性問題亟須解決。由于piRNA數(shù)目龐大，piRNA的鑒定要比miRNA更具挑戰(zhàn)性。然而，隨著芯片和高通量測序技術(shù)的完善，研究人員將能夠?qū)�piRNA的生物學(xué)功能進(jìn)行全面深入的研究。

 

Arraystar piRNA芯片

    Arraystar的科學(xué)家已經(jīng)研制了針對人、小鼠和大鼠的piRNA芯片，可以對piRNA的總體表達(dá)情況進(jìn)行檢測。三個物種的piRNA序列都來自NCBI數(shù)據(jù)庫，并且使用UCSC Blat技術(shù)在HG19, MM9 和 RN4數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行染色體定位（map）。我們采用恰當(dāng)?shù)牟呗詠硖暨x探針，然后使用雙重方法（duplex method）設(shè)計60 mer的反義寡核苷酸探針。使用我們專有的piRNA芯片（表1），我們將提供從樣品準(zhǔn)備到全面數(shù)據(jù)分析的綜合服務(wù)。

 

芯片名稱	物種	數(shù)據(jù)庫	格式	檢測的 piRNA數(shù)
Arraystar Human piRNA Array	Human	HG19	4 * 44K	23,677
Arraystar Mouse piRNA Array	Mouse	MM9	4 * 44K	43,537
Arraystar Rat piRNA Array	Rat	RN4	4 * 44K	39,727

 

康成生物piRNA芯片技術(shù)服務(wù)實驗流程

1. 樣品RNA抽提

    a. 實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，使用BioPulverizerTM冰凍粉碎組織，加1ml的RNA抽提試劑TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。

    b. 實驗對象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，加1ml的RNA抽提試劑TRIzol（樣品為貼壁細(xì)胞，每10cm2培養(yǎng)皿TRIzol使用量為1ml），裂解后抽提RNA。

2. RNA 質(zhì)量檢測

    a. 使用Nanodrop測定RNA 在分光光度計260nm 、280nm和230nm的吸收值，以計算濃度并評估純度。

    b. 用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測RNA 純度及完整性。

    c. 提供RNA QC報告。

        注意：用于芯片檢測的RNA樣品，必須是高質(zhì)量的，完整的，沒有RNase污染（降解的樣品不能用于標(biāo)記和芯片檢測），沒有基因組污染。

3. 制備熒光標(biāo)記探針

    使用Arraystar標(biāo)記試劑盒熒光標(biāo)記piRNA

4. 芯片雜交

    在標(biāo)準(zhǔn)條件下使用雜交儀將標(biāo)記好的探針和Arraystar piRNA芯片雜交。

5. 圖像采集和數(shù)據(jù)分析

    使用GenePix 4000B芯片掃描儀掃描芯片的熒光強(qiáng)度，并將實驗結(jié)果轉(zhuǎn)換成數(shù)字型數(shù)據(jù)保存，使用配套軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行分析運算。

6. 提供實驗報告—— 包括詳細(xì)的實驗方法和芯片實驗數(shù)據(jù)及圖表

   a. 芯片掃描圖

   b. 操作說明（含RNA質(zhì)檢報告）

   c. 芯片數(shù)據(jù)

   數(shù)據(jù)匯總表格（EXCEL格式，包含探針位置，探針名稱，原始信號值，修正信號值，標(biāo)準(zhǔn)化信號 值，樣品間piRNA表達(dá)量的比值）

   差異表達(dá)piRNA的數(shù)據(jù)表格（EXCEL格式，包含表達(dá)上調(diào)2倍的piRNA和表達(dá)下調(diào)2倍的piRNA）

   d. 進(jìn)一步數(shù)據(jù)分析

   Scatter Plot（主要針對單色重復(fù)實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性R值計算）

   分層聚類（進(jìn)行多個樣品實驗時，按基因表達(dá)相似程度進(jìn)行聚類，從而將多個樣品進(jìn)行歸類）

若進(jìn)行重復(fù)實驗（≥3）則計算CV值、p值，并做Volcano Plot

 

 

 

 

 

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