miRStar™ microRNA PCR芯片服務(wù)

miRStar™ Cancer Focus microRNA PCR芯片技術(shù)服務(wù)

    美國Arraystar公司是非編碼RNA研究領(lǐng)域的領(lǐng)導(dǎo)者， 近期Arraystar公司發(fā)布了創(chuàng)新性的miRStarTM 癌癥特異性microRNA PCR系統(tǒng)，能夠幫助客戶快速篩選microRNA分子標(biāo)志物，或是解析microRNA的調(diào)控機(jī)制和功能。其中，miRStar™癌癥特異性 microRNA芯片聚焦于血清Oncomir（癌癥相關(guān)的miRNA）,是microRNA癌癥分子標(biāo)志物的篩選利器；而miRStar™癌癥特異性microRNA & 靶基因 PCR芯片能夠同時(shí)檢測(cè)癌癥相關(guān)的microRNA和它們的靶基因，評(píng)估這些microRNA對(duì)靶標(biāo)mRNA的調(diào)控活性，從而幫助研究者篩選到癌癥中最為核心的功能microRNA分子，并迅速了解其調(diào)控機(jī)制和功能。
 

康成生物是Arraystar公司中國地區(qū)唯一代理商，獨(dú)家為您提供Arraystar公司miRStar™microRNA PCR芯片全程一站式技術(shù)服務(wù)，您只需要提供保存完好的組織或細(xì)胞標(biāo)本，康成的芯片技術(shù)服務(wù)人員就可為您完成全部實(shí)驗(yàn)操作，并提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告。

miRStar™癌癥特異性 microRNA PCR芯片產(chǎn)品列表

服務(wù)	芯片	規(guī)格	描述
NEW   miRStar™ Human Cancer Focus microRNA PCR Array Service	NEW Human Cancer Focus microRNA PCR Array	384-well plate	184個(gè)血清Oncomir
NEW  miRStar™ Human Cancer Focus microRNA & Target mRNA PCR Array Service	NEW Human Cancer Focus microRNA & Target mRNA PCR Array	384-well plate	184個(gè)癌癥相關(guān)的microRNA + 178個(gè)靶基因

 

miRStar™癌癥特異性 microRNA芯片 ---聚焦于血清Oncomir,分子標(biāo)志物篩選利器

聚焦于血清Oncomir

    microRNA在癌癥等疾病狀態(tài)下發(fā)生顯著的表達(dá)改變，多年積累的大量研究結(jié)果支持microRNA與癌癥的密切關(guān)系。近年來，研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，microRNA在血清，血漿，尿液等臨床樣品中穩(wěn)定存在。基于microRNA，特別是血清血漿microRNA 的癌癥分子生物學(xué)標(biāo)記物（biomarker）篩選方興未艾。為了幫助客戶篩選microRNA癌癥分子標(biāo)志物，Arraystar公司創(chuàng)新性的開發(fā)了miRStar™癌癥特異性 microRNA芯片。 miRStar™癌癥特異性 microRNA芯片聚焦于血清血漿Oncomir。它涵蓋了184個(gè)從最新的權(quán)威數(shù)據(jù)庫和經(jīng)典文獻(xiàn)中精心收集的，與胃癌﹑肝癌﹑肺癌﹑乳腺癌﹑卵巢癌﹑結(jié)直腸癌﹑胰腺癌﹑前列腺癌等常見腫瘤相關(guān)的microRNA（Oncomir）。更為重要的是，這些癌癥相關(guān)的microRNA都在血清樣品中經(jīng)過了嚴(yán)格的測(cè)試，證明了其在血清中的穩(wěn)定存在，因此非常適合于分子標(biāo)志物的篩選。

 

 

*圖釋：血清microRNA是重要的癌癥診斷分子標(biāo)記物
                                                   

microRNA作為分子生物學(xué)標(biāo)記物的優(yōu)勢(shì)

    ● 在血清/血漿，F(xiàn)FPE等臨床樣品中高度穩(wěn)定

    ● miRNA表達(dá)的呈現(xiàn)出高度的組織/疾病特異性

    ● 單個(gè)miRNA往往可以調(diào)控?cái)?shù)以百計(jì)的靶基因，因此只需通過少量的miRNA分子標(biāo)志物就可相對(duì)準(zhǔn)確的對(duì)疾病進(jìn)行診斷和預(yù)后判斷

    ● miRNA是重要的調(diào)控分子，不僅可以用作診斷（diagnosis）和預(yù)后（prognosis）標(biāo)志物還可以作為治療靶點(diǎn)

 

最優(yōu)的覆蓋—對(duì)癌癥相關(guān)的microRNA最全面，最及時(shí)的收集

    Arraystar實(shí)時(shí)的關(guān)注各種權(quán)威的文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫，并通過嚴(yán)謹(jǐn)?shù)暮Y選流程從中收集癌癥關(guān)系最密切的microRNA。miRStar™ 癌癥特異性microRNA PCR芯片是市場(chǎng)上對(duì)癌癥相關(guān)的microRNA覆蓋最全面、更新最及時(shí)、最合理的PCR芯片產(chǎn)品(見下表)。

 

癌癥類型	microRNA數(shù)目
乳腺癌	157
胃癌	97
肺癌	156
肝癌	113
卵巢癌	123
結(jié)直腸癌	130
胰腺癌	139
前列腺癌	140

*圖釋：miRStar™癌癥特異性 microRNA PCR芯片覆蓋的與特定癌癥相關(guān)的microRNA數(shù)目。

 

驗(yàn)證過的性能—芯片上的所有microRNA引物都在血清樣品中驗(yàn)證過

    miRStar™ 癌癥特異性microRNA PCR芯片上每條microRNA引物都經(jīng)過了精心的設(shè)計(jì)，并且在血清血漿樣品中進(jìn)行了驗(yàn)證（見下圖）。預(yù)驗(yàn)證的結(jié)果既確保了芯片的可靠性，又證實(shí)了這些癌癥相關(guān)的microRNA在血清血漿中的穩(wěn)定性，進(jìn)一步預(yù)示了其作為癌癥分子標(biāo)志物的可能性。

*圖釋：在血清樣品中，使用miRStar™ 預(yù)驗(yàn)證的 hsa-miR-142-3p特異性PCR引物的實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增曲線（A）和熔解曲線（B）。溶解曲線呈現(xiàn)銳利的單峰，表明了反應(yīng)具有很高的特異性。

同時(shí)檢測(cè)兩個(gè)樣品—樣品間技術(shù)誤差可以忽略不計(jì)

    miRStar™癌癥特異性 microRNA PCR芯片可以在同一塊PCR板上同時(shí)檢測(cè)2個(gè)樣品，如癌癥樣品 vs 正常樣品或是兩個(gè)生物學(xué)重復(fù)，樣品間的技術(shù)誤差幾乎可以忽略不計(jì)。

 

miRStar™癌癥特異性 microRNA & 靶基因芯片 ---同時(shí)檢測(cè)microRNA和靶基因,microRNA功能解析利器

    microRNA可以通過堿基互補(bǔ)的方式和靶標(biāo)mRNA結(jié)合，而后降解mRNA沉默基因的表達(dá)。一個(gè)microRNA 可以調(diào)控近百個(gè)不同的mRNA分子，另一方面，一個(gè)mRNA也能夠結(jié)合多個(gè)不同的microRNA. 由此形成microRNA-靶基因網(wǎng)絡(luò)調(diào)控關(guān)系。在癌癥研究領(lǐng)域中，microRNA已經(jīng)成為一個(gè)非常重要的部分。不同類型癌癥樣品具有不同的基因表達(dá)模式，因此，即使是相同的microRNA，它們?cè)诓煌�類型的癌癥樣品中的調(diào)控的靶基因往往是不同的。

    傳統(tǒng)的microRNA檢測(cè)平臺(tái)只檢測(cè)microRNA的表達(dá)狀況，不能平行的檢測(cè)microRNA和靶基因，從而無法全面的了解microRNA-靶基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

    Arraystar公司開創(chuàng)性的設(shè)計(jì)了miRStar™microRNA PCR芯片系統(tǒng)，可以同時(shí)檢測(cè)癌癥相關(guān)的microRNA和它們的靶基因。它不僅能夠快速檢測(cè)樣品中癌癥相關(guān)的microRNA的表達(dá)變化，還可以評(píng)估這些microRNA對(duì)靶標(biāo)mRNA的調(diào)控活性，從而幫助研究者篩選到疾病中最為核心的功能microRNA分子，并迅速了解其調(diào)控機(jī)制和功能。

 

同時(shí)檢測(cè)癌癥相關(guān)的microRNA和靶基因

    miRStar™癌癥特異性microRNA & 靶基因 PCR芯片包含癌癥相關(guān)的184個(gè)microRNA以及這些microRNA的178個(gè)靶標(biāo)mRNA分子。184個(gè)microRNA是從最新的文獻(xiàn)中精心篩選，涵蓋了與胃癌，肝癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌，結(jié)直腸癌，胰腺癌，前列腺癌等常見腫瘤相關(guān)的microRNA（見下表）。178個(gè)靶mRNA有大量的文獻(xiàn)支持，其表達(dá)水平的變化與腫瘤中microRNA的功能活性改變有關(guān)。通過創(chuàng)新性的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（見下圖），miRStar™癌癥特異性microRNA & 靶基因 PCR芯片實(shí)現(xiàn)了對(duì)microRNA和 靶mRNA的同時(shí)檢測(cè)，采用高效，優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)流程，起始RNA量可低至50ng。

*圖釋：miRStar™癌癥特異性microRNA & 靶基因 PCR芯片包含的microRNA（黃色背景），mRNA（紫色背景）和內(nèi)參（紅色方框）.

*圖釋：miRStar™癌癥特異性microRNA & 靶基因PCR芯片工作流程。

康成生物microRNA PCR芯片主要實(shí)驗(yàn)流程

1.樣品RNA抽提

   a.實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，使用BioPulverizerTM冰凍粉碎組織，加1ml的RNA抽提試劑TRIzol（Invitrogen），使用Mini-Bead-Beater-16勻漿后抽提RNA。

   b.實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，加1ml的RNA抽提試劑TRIzol（樣品為貼壁細(xì)胞，每10cm2培養(yǎng)皿TRIzol使用量為1ml），裂解后抽提RNA。

2.DNase I消化RNA樣品

   DNase I在37°C溫育處理RNA樣品，去除RNA抽提過程中可能混入的基因組DNA。

3.RNA純化

   RNeasy MinElute純化試劑盒（Qiagen）對(duì)DNase I處理的RNA樣品純化回收，以得到單純的RNA樣本。

4.RNA質(zhì)量檢測(cè)

   a.使用Nanodrop測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm、280nm和230nm的吸收值，以計(jì)算濃度并評(píng)估純度。

   b.用甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。

   c.提供RNA QC報(bào)告。

5.cDNA合成

   按照miRStarTM第一鏈cDNA合成試劑盒使用說明將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA (oligo dT和miRStarTM microRNA反轉(zhuǎn)引物)。

6.實(shí)時(shí)定量PCR

   按照芯片說明將cDNA模板適當(dāng)稀釋后加入到實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)混合液中，然后在含有基因特異性引物的384孔板各孔中加入等量反應(yīng)液，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。

7.數(shù)據(jù)分析

   利用配套軟件計(jì)算PCR芯片中的各個(gè)基因的Ct值，采用公認(rèn)的ΔΔCt方法比較基因的表達(dá)變化。

   a.計(jì)算每個(gè)處理組中的每個(gè)microRNA和靶基因的ΔCt（microRNA和靶基因分別用各自的內(nèi)參基因）。

   ΔCt (Ctrl) = average Ct - average of HK genes’Ct for Ctrl array

   ΔCt (Exp) = average Ct - average of HK genes’Ct for Exp array

   b.計(jì)算2個(gè)PCR Array中每個(gè)基因的ΔΔCt。

   ΔΔCt = ΔCt (Exp) - ΔCt (Ctrl)

   c.通過2-ΔΔCt計(jì)算Exp（實(shí)驗(yàn)組）與Ctrl（對(duì)照組）間基因的表達(dá)差異。

8.提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告

   Gene table（PCR板所含的基因列表）

   Excel芯片結(jié)果匯總表（包括芯片原始結(jié)果、數(shù)據(jù)分析和各種圖表）

 

康成生物microRNA PCR芯片數(shù)據(jù)分析

1. 差異microRNA篩選

    microRNA的qPCR數(shù)據(jù)展示在“microRNA expression data”數(shù)據(jù)表格中，表達(dá)有差異（>2倍）或有顯著性（P<0.05）的數(shù)據(jù)用有顏色的字體標(biāo)注，客戶可以很方便的根據(jù)自身要求，利用倍數(shù)變化和P值在列表中篩選差異microRNA，常用篩選標(biāo)準(zhǔn)：倍數(shù)變化>2倍，P<0.05。

 

 

*圖釋：差異microRNA篩選示例

 

2. 差異mRNA篩選 (僅適用于miRStar™癌癥特異性 microRNA & 靶基因芯片)

    靶mRNA的qPCR數(shù)據(jù)展示在“mRNA expression data”數(shù)據(jù)表格中，表達(dá)有差異（>2倍）或有顯著性（P<0.05）的數(shù)據(jù)用有顏色的字體標(biāo)注，客戶可以很方便的根據(jù)自身要求，利用倍數(shù)變化和P值在列表中篩選差異microRNA，常用篩選標(biāo)準(zhǔn)：倍數(shù)變化>2倍，P<0.05。

 

 

 

*圖釋：差異mRNA篩選示例

 

3. 差異microRNA與靶mRNA的聯(lián)合分析 (僅適用于miRStar™癌癥特異性 microRNA & 靶基因芯片)

    我們還將差異表達(dá)的microRNA（一般篩選標(biāo)準(zhǔn)為：倍數(shù)變化>=2倍，P<0.05）與其靶mRNA的表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，相應(yīng)的數(shù)據(jù)展示在“microRNA-mRNA data”數(shù)據(jù)表格中。如果microRNA的靶基因與其表達(dá)趨勢(shì)相反，并且也在樣品組間呈現(xiàn)出顯著性的差異，那么在此類樣品中這個(gè)靶基因可能是此microRNA真實(shí)的靶基因。microRNA與靶mRNA的作用位點(diǎn)，可能的細(xì)胞學(xué)功能，以及相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)來源也列在表格中。

 

 

*圖釋： 差異microRNA和靶mRNA的聯(lián)合分析示例

4. 散點(diǎn)圖
     客戶可以根據(jù)散點(diǎn)圖直觀的看到表達(dá)上下調(diào)的基因，及其上下調(diào)程度

*圖釋：散點(diǎn)圖示例。位于灰色條帶上方的是上調(diào)倍數(shù)大于2倍的microRNA/mRNA，位于灰色條帶下方的是下調(diào)倍數(shù)大于2倍的microRNA/mRNA

 

5. 3D圖
     可以直觀的了解表達(dá)上下調(diào)的基因，及其在PCR板上的位置

 

*圖釋：3D圖示例。縱軸為基因表達(dá)倍數(shù)變化，橫縱軸分別代表相應(yīng)基因在PCR板上的位置。

mirstar芯片microRNA列表.pdf

 

 

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