NuRNA™ 人類tRNA修飾酶PCR芯片技術(shù)服務(wù)

    tRNA是基因與蛋白之間重要的信息傳遞者，通過與特定氨基酸結(jié)合而發(fā)揮功能。越來越多的文獻表明，tRNA及其來源的RNA片段（tRFs）在細胞增殖、分化、代謝、應(yīng)激反應(yīng)以及多種疾病中發(fā)揮著調(diào)控作用^[1]。tRNA攜帶種類豐富、數(shù)目眾多的轉(zhuǎn)錄后修飾。這些修飾為tRNA功能發(fā)揮所必需，參與tRNA的正確折疊，穩(wěn)定維持和基因解碼功能。比如，位于頸環(huán)部位的修飾影響tRNA的折疊與穩(wěn)定性，反密碼子環(huán)上的修飾確保翻譯準確性，34號位置的修飾決著密碼子的擺動性，反密碼子環(huán)附近的修飾調(diào)控密碼子與反密碼子識別（圖1）。
    tRNA修飾受各類tRNA修飾相關(guān)蛋白的動態(tài)調(diào)控^[2]，這些蛋白突變或者功能紊亂，與多種疾病的發(fā)生有關(guān)。例如，NSUN2負責(zé)催化胞嘧啶5’甲基化，其突變會導(dǎo)致機體頭小畸形癥^[3]；t6A甲硫基轉(zhuǎn)移酶CDKAL1功能紊亂可誘發(fā)Ⅱ型糖尿病^[4]。tRNA修飾對于疾病治療的重要性，以及這些修飾是如何被調(diào)控，仍待進一步的研究^[5,6]。

圖1. 人類tRNA修飾類型與修飾相關(guān)蛋白。

      美國Arraystar公司最新發(fā)布了市場上首款聚焦tRNA修飾蛋白檢測的PCR芯片 ——NuRNA™ tRNA Modification Enzymes PCR Array。參考已有文獻與權(quán)威數(shù)據(jù)庫（UniProt和Modomics），此款芯片囊括了85個tRNA修飾酶和蛋白因子，覆蓋了所有已知的tRNA修飾酶。PCR芯片上的每對引物在多個組織和細胞系中通過了嚴格驗證。

產(chǎn)品信息：

芯片特點：
• 覆蓋度廣—囊括了UniProt與Modomics中所有已知的tRNA修飾酶/蛋白因子
• 嚴謹性強—所有引物都通過了多樣本嚴格驗證
• 快速簡易—即用型384孔板規(guī)格，只需將cDNA與qPCR Master Mix混合試劑加入PCR板中，4小時內(nèi)得到實驗結(jié)果。cDNA無需預(yù)先擴增。

表1.tRNA修飾酶/蛋白因子（修飾類型）

注：tRNA修飾縮寫參考Modomics數(shù)據(jù)庫，基因名參考UniProt。

PCR芯片實驗流程
1. RNA抽提與質(zhì)量檢測
進行RNA常規(guī)抽提，使用NanoDrop ND-1000檢測RNA濃度和純度，使用瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。詳細的樣品QC結(jié)果見Arraystar服務(wù)報告。
2. cDNA合成
每樣本取1.5 μg RNA，使用rtStar™ First-Strand Synthesis Kit (Cat# AS-FS-001, Arraystar) 試劑盒合成cDNA第一鏈。詳細步驟參照Arraystar產(chǎn)品操作手冊。
3. Real-time PCR擴增
將cDNA與 Arraystar SYBR Green qPCR Master Mix (Cat# AS-MR-005-5, Arraystar)混合，加入至384孔板中，在ABI 7900 PCR儀上進行Real-time PCR擴增。
4. 熔解曲線分析與原始數(shù)據(jù)導(dǎo)出
PCR擴增完成后，進行熔解曲線分析，使用PCR儀自帶軟件導(dǎo)出原始數(shù)據(jù)。出具Raw Data文件夾，包含原始Ct值、PCR擴增曲線圖和熔解曲線圖。

PCR芯片數(shù)據(jù)分析流程
1. PCR芯片數(shù)據(jù)質(zhì)控
質(zhì)控參數(shù)：Ct(Blank)>35; Ct(GDC)>35; Ct(RNA Spike-in)<25; Ct (PPC) <25. 符合上述條件的樣本進入下一步分析。
2. 數(shù)據(jù)校正與△Ct值計算
板間校正：使用Ct(PPC)對不同PCR板進行板間校正。
內(nèi)參校正與△Ct值計算：挑選最優(yōu)內(nèi)參，使用內(nèi)參均值計算△Ct值。
3. 差異倍數(shù)計算 (2^(-△△Ct))
使用 △△Ct 方法計算不同樣品組之間的表達差異倍數(shù)。
4. P值計算
對樣本組進行t檢驗，計算P值。
5. 其他常規(guī)數(shù)據(jù)分析
散點圖分析；火山圖分析；TOP20表達上調(diào)和下調(diào)transcript柱形圖分析
6. 提供服務(wù)報告與數(shù)據(jù)分析結(jié)果
a. Arraystar服務(wù)報告（包括RNA樣本QC和詳細實驗數(shù)據(jù)分析步驟）
b. Excel芯片結(jié)果匯總表（包括Transcript列表，數(shù)據(jù)分析結(jié)果和各類圖表）
c. Raw Data文件夾 (包含原始數(shù)據(jù)、擴增曲線圖和熔解曲線圖)

NuRNA™ Human tRNA Modification Enzymes PCR芯片服務(wù)部分結(jié)果展示
1. 差異表達轉(zhuǎn)錄本列表（默認篩選參數(shù)：差異倍數(shù)>2；P<0.05，客戶可指定篩選參數(shù)值）

2. 散點圖 (黑色斜線代表差異倍數(shù)為1，紅色斜線代表差異倍數(shù)為2)

3. 火山圖（黑色垂線代表差異倍數(shù)為1；粉色垂線代表上調(diào)或下調(diào)倍數(shù)為2；藍色水平線代表P值為0.05）

4. TOP20表達上調(diào)transcript柱狀圖

5. TOP20表達下調(diào)transcript柱狀圖

參考文獻：
[1] Kirchner S, Ignatova Z. Emerging roles of tRNA in adaptive translation, signalling dynamics and disease. Nature reviews Genetics 2015;16:98-112.
[2] El Yacoubi B, Bailly M, de Crecy-Lagard V. Biosynthesis and function of posttranscriptional modifications of transfer RNAs. Annual review of genetics 2012;46:69-95.
[3] Blanco S, Dietmann S, Flores JV, Hussain S, Kutter C, Humphreys P, et al. Aberrant methylation of tRNAs links cellular stress to neuro-developmental disorders. The EMBO journal 2014;33:2020-39.
[4] Zhou B, Wei FY, Kanai N, Fujimura A, Kaitsuka T, Tomizawa K. Identification of a splicing variant that regulates type 2 diabetes risk factor CDKAL1 level by a coding-independent mechanism in human. Human molecular genetics 2014;23:4639-50.
[5] Zhang X, Cozen AE, Liu Y, Chen Q, Lowe TM. Small RNA Modifications: Integral to Function and Disease. Trends in molecular medicine 2016.
[6] Suzuki T, Nagao A, Suzuki T. Human mitochondrial tRNAs: biogenesis, function, structural aspects, and diseases. Annual review of genetics 2011;45:299-329.