DNA甲基化芯片服務(wù)

 表觀基因組是目前多組學(xué)研究的熱點(diǎn)，而DNA的甲基化修飾又是表觀遺傳研究中最重要的領(lǐng)域。DNA甲基化修飾是基因表達(dá)調(diào)控的重要方式，在分化、發(fā)育、基因印跡、X染色體失活與維持組織特異性等眾多方面起著重要作用。同時(shí)在許多復(fù)雜疾病，如癌癥、神經(jīng)系統(tǒng)紊亂、糖尿病等，的發(fā)生發(fā)展也與DNA甲基化有著千絲萬縷的關(guān)系。
在后基因組時(shí)代，隨著高通量技術(shù)成本的日益降低，海量組學(xué)數(shù)據(jù)與研究結(jié)果讓我們越來越認(rèn)識到生命現(xiàn)象的復(fù)雜性。目前的研究前沿越來越傾向于以多組學(xué)的角度：從遺傳和表觀遺傳到轉(zhuǎn)錄和代謝，從機(jī)制到表型，進(jìn)行整合研究以得到全局結(jié)果。
在當(dāng)前的科研需求下，Illumina的甲基化芯片Infinium MethylationEPIC BeadChip（簡稱850k芯片），提供了性能優(yōu)越且經(jīng)濟(jì)可靠的甲基化解決方案。850K芯片是在原450K芯片巨大成功的基礎(chǔ)上，推出了新一代的DNA甲基化芯片。在數(shù)據(jù)上既包含了原450K芯片91%的位點(diǎn)，以充分利用原有450K珍貴數(shù)據(jù)，又增加了413,745個(gè)位點(diǎn)（總共853,307個(gè)CpG位點(diǎn)）。850K芯片全面覆蓋基因啟動(dòng)子區(qū)、基因編碼區(qū)、CpG島以及ENCODE及FANTOM5計(jì)劃中發(fā)現(xiàn)的增強(qiáng)子區(qū)（圖 1）。
850K甲基化芯片不但是腫瘤和其他復(fù)雜疾病研究的有力工具，也是目前最適合表觀全基因組關(guān)聯(lián)分析（EWAS）研究的DNA甲基化研究技術(shù)。 

• 芯片原理

850K芯片沿承了Illumina應(yīng)用在450K芯片中經(jīng)典的BeadArray技術(shù)，通過Infinium I及II探針設(shè)計(jì),在對目標(biāo)區(qū)域全面覆蓋的同時(shí)也保證數(shù)據(jù)穩(wěn)定可靠。
Infinium I的設(shè)計(jì)是通過兩種不同的探針的信號值來區(qū)分甲基化的CpG位點(diǎn)（C）和非甲基化的CpG位點(diǎn)（T）的比例；而在Infinium II的設(shè)計(jì)中，每個(gè)檢測位點(diǎn)只設(shè)計(jì)一個(gè)探針，通過比較該探針摻入的兩種熒光的信號值來計(jì)算目的位點(diǎn)的甲基化比例。詳見下表與圖3。 圖 2 Infinium I與Infinium II 探針設(shè)計(jì)原理圖：在InfiniumI設(shè)計(jì)中，每個(gè)甲基化位點(diǎn)都對應(yīng)設(shè)計(jì)有兩種探針：M型磁珠、U型磁珠分別檢測甲基化位點(diǎn)（C）。和非甲基化位點(diǎn)(T)。根據(jù)單堿基延伸的原理，僅當(dāng)探針最后一個(gè)堿基與模板配對時(shí)，熒光標(biāo)記的ddNTP才能摻入并被檢測到熒光信號，并根據(jù)M和U的熒光信號的結(jié)果計(jì)算甲基化值。而Infinium Ⅱ 探針只使用一種磁珠，通過延伸的A或G堿基（分別對應(yīng)非甲基化與甲基化位點(diǎn)）的信號值計(jì)算目的位點(diǎn)的甲基化程度。

 850k芯片技術(shù)特點(diǎn)： 
1. 全面的基因組覆蓋范圍：檢測>853,000個(gè)CpG位點(diǎn)，全面覆蓋CpG島、啟動(dòng)子、編碼區(qū)、開放染色質(zhì)和增強(qiáng)子。此外還包括CpG島外的CpG位點(diǎn)，已知DMR位點(diǎn)，脫氧核糖核酸酶超敏位點(diǎn)以及miRNA啟動(dòng)子區(qū)域。
2. 高質(zhì)量的數(shù)據(jù)：同時(shí)采用Infinium I及II探針設(shè)計(jì)，使檢測范圍最大化。
3. 分辨率高：單堿基分辨率，可以直接檢測到發(fā)生甲基化的確切位點(diǎn)。
4. 可重復(fù)性高： 自身技術(shù)重復(fù)相關(guān)性R² > 0.98；與450K交集探針間相關(guān)性R² > 0.98。
5. 起始模板量低：僅需 250ng，大大節(jié)約了樣品量。
6. 適用于FFPE樣本。

• 850K芯片探針覆蓋技術(shù)參數(shù)
  850K芯片傳承了450K芯片對基因組的功能元件的設(shè)計(jì)理念，有目的性地對CpG島以及基因及實(shí)現(xiàn)了空前全面覆蓋,下圖及表格統(tǒng)計(jì)展示了850K芯片對于不同染色體、基因組功能元件的覆蓋及分布。以上的設(shè)計(jì)不但可從泛-增強(qiáng)子及編碼區(qū)域角度分析甲基化組，還在全基因組表觀遺傳關(guān)聯(lián)研究（EWAS）中發(fā)揮重要作用。850K芯片中包含的一系列有價(jià)值的位點(diǎn)：
  
  
   
• CpG島及島外的CpG位點(diǎn)（Island:17.8%, Shore: 16.9%, Shelf: 8.8%, Open sea: 56.5%）
• 人類胚胎干細(xì)胞中的非CpG甲基化位點(diǎn)（CHH位點(diǎn)）
• 腫瘤vs正常（多種類型的癌癥），以及不同組織間的差異甲基化位點(diǎn)
• FANTOM5增強(qiáng)子, ENCODE開放染色質(zhì)和增強(qiáng)子
• DNase I超敏位點(diǎn)
• miRNA啟動(dòng)子區(qū)域
  
  
  圖 3. 850K 芯片探針在不同染色體及基因組功能元件中的分布。
  
   
• 芯片數(shù)據(jù)的可靠性

Illumina Infinium Methylation EPIC是一款優(yōu)秀的芯片，秉承了450K芯片可靠而穩(wěn)定的特點(diǎn)�；�于Infinium I 與InfiniumII的靈活設(shè)計(jì)，使得探針可通過簡并堿基的原則覆蓋于CpG位點(diǎn)密集的區(qū)域，同時(shí)保證目的位點(diǎn)的結(jié)果不受到周圍CpG位點(diǎn)的影響。
芯片數(shù)據(jù)的穩(wěn)定與可靠可以通過芯片的技術(shù)重復(fù)直觀的體現(xiàn)，對于850K芯片，其本身的技術(shù)重復(fù)相關(guān)性R²>0.98，而且850K芯片與450K芯片有交集的探針的結(jié)果的相關(guān)R²>0.98。此外，相同樣本在Illumina甲基化芯片與WGBS兩種技術(shù)平臺中產(chǎn)出的數(shù)據(jù)相關(guān)性R²>0.95。 圖 4 EPIC芯片自身技術(shù)重復(fù)間的相關(guān)性以及與450K有交集的探針間的相關(guān)性R方都在0.98以上。此外450K芯片與WGBS的交集位點(diǎn)的相關(guān)性R²>0.95
 

• 850K芯片對于FFPE樣品的通用性

目前生物樣本庫中的大部分標(biāo)本都是FFPE樣本，這些樣本不但數(shù)量眾多，而且多包含有詳細(xì)的病理及隨訪信息，是進(jìn)行疾病機(jī)制研究的珍貴材料。不過經(jīng)福爾馬林固定、石蠟包埋后的FFPE樣本所抽提的DNA質(zhì)量很差，不但片段化嚴(yán)重，而且會(huì)出現(xiàn)大量的未知化學(xué)修飾與交聯(lián)。Illumina為FFPE樣本的甲基化檢測改進(jìn)了protocol，對于FFPE樣本可獲得更可靠而穩(wěn)定的結(jié)果。經(jīng)驗(yàn)證，對于相同樣本分別進(jìn)行FFPE與新鮮冰凍處理兩種保存手段下，以及FFPE樣本的技術(shù)重復(fù)，850K芯片都展示了穩(wěn)定與優(yōu)質(zhì)的數(shù)據(jù)[1, 2]。 圖 5  850K芯片對于FFPE樣本的可靠性：在官方文件以及驗(yàn)證性相同標(biāo)本分別用FFPE處理與新鮮冰凍處理，850K芯片結(jié)果的重復(fù)相關(guān)性R²>0.98（R=0.994）。850K芯片對于FFPE樣本的技術(shù)重復(fù)相關(guān)性（R2>0.98）及檢出率(>90%)。 
 

• 樣本要求：

1. 樣品總量：每個(gè)樣品總量不少于2ug。
2. 樣品濃度：最低濃度不低于50ng/ul。
3. 樣品純度：OD 260/280值應(yīng)在1.7～1.9 之間。
4. 樣品質(zhì)量：基因組完整、無降解、無RNA污染，無其他基因組DNA污染。
5. 樣品運(yùn)輸：DNA低溫運(yùn)輸（-20℃）；且在運(yùn)輸過程中請用封口膜將樣本密封好，以防出現(xiàn)污染。

• 數(shù)據(jù)分析內(nèi)容
   

  基礎(chǔ)分析	高級分析
  1．原始數(shù)據(jù)預(yù)處理	1．特定基因組區(qū)段的DMR展示
  2．?dāng)?shù)據(jù)歸一化（甲基化位點(diǎn)總表，含注釋信息)	2．甲基化與轉(zhuǎn)錄的關(guān)聯(lián)分析，網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建
  3．QC結(jié)果（beta值密度曲線，聚類圖，PCA圖，相關(guān)性圖）	3．差異甲基化基因中鄰近啟動(dòng)子區(qū)域motif的識別
  4．差異甲基化位點(diǎn)（含注釋信息）	4．其它個(gè)性化分析內(nèi)容。
  5．差異甲基化位點(diǎn)的染色體分布
  6．差異甲基化位點(diǎn)的基因功能注釋與富集
  7．差異甲基化位點(diǎn)的熱圖展示

• 甲基化分析結(jié)果示意

1. 、數(shù)據(jù)QC結(jié)果

通過探針的β值密度曲線、樣本的非監(jiān)督聚類圖和PCA圖等，整體的展示項(xiàng)目中所有樣本，在組間與組內(nèi)的差異以及相互關(guān)系，不但能夠?qū)�樣本整體數(shù)據(jù)質(zhì)量有一個(gè)直觀的了解，同時(shí)還可以考察數(shù)據(jù)結(jié)果與項(xiàng)目設(shè)計(jì)是否吻合。 圖 6數(shù)據(jù)QC圖。A. 探針beta值密度曲線圖，將原始數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化及過濾掉不合格的探針后，對各樣本的探針的β值的分布曲線進(jìn)行展示，可以比較實(shí)驗(yàn)組與對照組間整體的甲基化分布是否有差異，也可以考察是否有個(gè)別樣本的整體甲基化程度發(fā)生了改變。B. 樣本的非監(jiān)督聚類聚類圖，數(shù)據(jù)接近的樣本，在關(guān)系樹中位于更近的位置。C. PCA圖，在二維或三維空間中以空間距離展示樣本間相互關(guān)系的遠(yuǎn)近。對芯片中超過85萬探針（特征）進(jìn)行降維處理，以2~3個(gè)主成分差異代替85萬個(gè)探針的差異。D. 樣本的相關(guān)性圖，通過熱圖矩陣的形式，分別比較每個(gè)樣本與其余所有樣本間的相關(guān)性，可將聚類結(jié)果結(jié)合相關(guān)性圖進(jìn)行展示。聚類圖、PCA圖以及相關(guān)性圖，都是直觀展示樣本間相關(guān)性、組間差異以及組內(nèi)差異的QC結(jié)果圖，用于考察實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)與項(xiàng)目設(shè)計(jì)是否吻合。
 
2、甲基化差異結(jié)果
Ø  差異甲基化位點(diǎn)
差異甲基化的篩選是整個(gè)數(shù)據(jù)分析過程中的主要環(huán)節(jié)，其中包括差異甲基化位點(diǎn)以及差異甲基化區(qū)域（DMR）。
組間的差異甲基化位點(diǎn)中有兩個(gè)關(guān)鍵值：
Ø  Δβ值：直接用兩組的各CpG位點(diǎn)的甲基化值（β值）相減得到。
Ø  p值：當(dāng)每組樣本在3個(gè)以上時(shí)，DMP 的p值是利用 R 語言的 limma 包中的線性模型計(jì)算得到。并對p值采用 Benjamini & Hochberg 方法進(jìn)行多重檢驗(yàn)糾正。 圖 7差異甲基化位點(diǎn)在染色體定位，高甲基化或低甲基化的基因是否有染色體的偏向性或成簇分布的特點(diǎn)。其中紅色代表實(shí)驗(yàn)組高甲基化位點(diǎn)，綠色代表實(shí)驗(yàn)組低甲基化基因位點(diǎn)，灰色表示甲基化位點(diǎn)在組間沒有變化。熱圖展示顯著差異的CpG甲基化位點(diǎn)在不同組間各樣本中的分布，并可作為樣本分類的標(biāo)志物。
 
Ø  差異甲基化區(qū)域（DMR）
在基因組中差異甲基化位點(diǎn)經(jīng)常會(huì)成簇出現(xiàn)，形成一段差異甲基化區(qū)域（Differentially Methylated Region, DMR）。DMR代表著某個(gè)染色體區(qū)段整體的去甲基化或超甲基化，區(qū)段的范圍小至數(shù)百bp，大到Mb級別[3]。DMR在被認(rèn)為在基因印記調(diào)節(jié)、細(xì)胞分析等過程中起重要作用。
  圖 8. DMR示意圖。在染色體的Kb以至Mb范圍內(nèi)展示組間的甲基化修飾程度的差異。
 
3、甲基化與基因組或轉(zhuǎn)錄組共同分析
生命現(xiàn)象的背后有著復(fù)雜的遺傳基礎(chǔ)與精密的調(diào)控分子機(jī)制，基因組的DNA序列構(gòu)建了遺傳基礎(chǔ)；甲基化修飾、組蛋白修飾和lncRNA的轉(zhuǎn)錄前調(diào)控，非編碼RNA（包括miRNA, lncRNA與circRNA）的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，以及翻譯后的蛋白修飾等組成了復(fù)雜而精密的調(diào)控過程；mRNA、蛋白的表達(dá)高低或修飾情況以及代謝物的豐度是以上過程為適應(yīng)環(huán)境而共同作用的目的和結(jié)果。僅靠單一組學(xué)的分析只能在單個(gè)層面中得到信息，并不能從整體上理解疾病與生命過程發(fā)生的來龍去脈。在后基因組時(shí)代，科學(xué)研究會(huì)朝著更全面、更精細(xì)的方向發(fā)展，多組學(xué)研究以至系統(tǒng)生物學(xué)研究將是一個(gè)大趨勢。
我們?yōu)槎嘟M學(xué)研究提供了整體解決方案，其中也包括數(shù)據(jù)分析的思路與結(jié)果展示的方法。多組學(xué)的分析可通過基因組-轉(zhuǎn)錄組、基因組-甲基化-轉(zhuǎn)錄組、甲基化-轉(zhuǎn)錄組等不同形勢。
  圖 9. 甲基化高級分析：A. 甲基化與表達(dá)譜相關(guān)性熱圖，此類型的圖也可展示其他不同組學(xué)的相關(guān)性。B. 基因組、轉(zhuǎn)錄組與甲基化組變異通路圖，可在同一張圖上展示通路中的基因組、轉(zhuǎn)錄組與甲基化組等不同組學(xué)上的變異，以及多組學(xué)的變異對通路的影響。C. 關(guān)鍵基因的多組學(xué)相關(guān)性圖，以相關(guān)性圖的形式，同時(shí)展示關(guān)鍵基因在基因組、轉(zhuǎn)錄組與甲基化等多組學(xué)層面上的相關(guān)性，共變異或甲基化狀態(tài)。