單細(xì)胞TCR/BCR 測(cè)序｜單細(xì)胞免疫組庫測(cè)序

免疫組庫（Immune Repertoire，IR）是指機(jī)體內(nèi) T 淋巴細(xì)胞和 B 淋巴細(xì)胞多樣性的總和，反映機(jī)體免疫系統(tǒng)在特定時(shí)間段內(nèi)應(yīng)對(duì)外界刺激應(yīng)答的能力�；�于 10X Genomics 的單細(xì)胞系統(tǒng)，可實(shí)現(xiàn)高通量的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 V(D)J 測(cè)序。不但可以將 TCR/BCR 雙鏈匹配，而且能夠同時(shí)獲得基因表達(dá)信息。

10X Genomic 單細(xì)胞免疫組庫測(cè)序與單細(xì)胞 RNA 測(cè)序一樣，通過微流控系統(tǒng)將帶有條形碼和引物的凝膠珠與單個(gè)細(xì)胞包裹在油滴中；接下來在每個(gè)油滴內(nèi)，凝膠珠溶解，細(xì)胞裂解釋放 mRNA，通過逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA。破油（Breaking Emulsions）之后，cDNA 一分為二，后續(xù)同時(shí)進(jìn)行基因表達(dá)和免疫組庫的文庫構(gòu)建。其中 TCR 或者 BCR 的 V(D)J 序列通過設(shè)計(jì)在 C 區(qū)的巢式引物進(jìn)行 PCR 富集；而 mRNA 的信息，與 10X Genomics 3’mRNA 文庫不同，保留的是 5’端的信息。測(cè)序后即可一次性獲得大量單細(xì)胞的基因表達(dá)和免疫組庫數(shù)據(jù)。

圖 5’mRNA 與 TCR/BCR 同時(shí)建庫

1、通量高：一張芯片具有 8 個(gè)獨(dú)立的通道，可供 8 個(gè)樣本同時(shí)上機(jī)，每個(gè)通道可捕獲 10000 個(gè)細(xì)胞。

2、分辨率高：可獲得真正單細(xì)胞水平的的免疫組庫信息，并且可匹配 TCR/BCR 的雙鏈。

3、信息豐富：可同時(shí)獲得單個(gè)細(xì)胞匹配的 mRNA 和 TCR/BCR 信息。

文庫結(jié)構(gòu)

5’gene expression 文庫

圖 10X Genomics 5’gene expression 文庫示意圖

V(D)J 文庫

圖 10X Genomics V(D)J 文庫示意圖

建議測(cè)序深度及參數(shù)

1、類型：新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。

2、來源：血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

3、樣本量及其它質(zhì)控要求：

4、樣本的保存與運(yùn)輸

1、腫瘤微環(huán)境；

2、自身免疫性疾��；

3、感染性疾��；

4、器官、骨髓移植；

5、抗體開發(fā)。

1、肝癌免疫微環(huán)境

2017 年，北京大學(xué)張澤民教授課題組通過大規(guī)模單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)對(duì)肝癌相關(guān) T 淋巴細(xì)胞進(jìn)行了分析，在單細(xì)胞水平上描繪肝癌微環(huán)境中免疫圖譜。研究者收集了 6 例肝癌患者的外周血，癌旁正常組織、肝癌組織作為實(shí)驗(yàn)樣本，然后從各類樣本中用流式分選出 CD3+CD8+（cytotoxic T cells，Tc）細(xì)胞，以及 CD4+CD25-（Helper T cells，Th）細(xì)胞和 CD4+CD25+（regulatory T cells，Tregs）細(xì)胞，并進(jìn)行了單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和單細(xì)胞 TCR 測(cè)序，總共獲得 5063 個(gè)單細(xì)胞的數(shù)據(jù)。其中，單細(xì)胞水平分析 TCR 序列發(fā)現(xiàn)，在腫瘤侵潤的 exhausted T 細(xì)胞和 Tregs 細(xì)胞中，觀察到 TCRs 發(fā)生了重復(fù)使用。在腫瘤組織中含有相同 TCR 的 T 細(xì)胞比例較高，而在外周血和正常組織中比例較低，這說明在腫瘤中的 exhausted T 細(xì)胞和 Tregs 細(xì)胞發(fā)生了克隆擴(kuò)增。并且相比于早期病人，晚期病人中 T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增更加明 顯。

圖 肝癌中 T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增

2、黑色素瘤免疫微環(huán)境

2019 年發(fā)表在 Cell 上發(fā)表的一篇論文，對(duì) 25 個(gè)黑色素瘤患者腫瘤中總共 46,621 個(gè)免疫細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 和 TCR 測(cè)序。這些細(xì)胞被分成 7 個(gè)大群，包括 T 細(xì)胞（CD3），NK 細(xì)胞（KLRD1），樹突細(xì)胞（DCs；CD1C），巨噬細(xì)胞（C1Q），單核細(xì)胞（VCAN），B 細(xì)胞（CD19），和漿細(xì)胞（immunoglobulins）。初始 T 細(xì)胞高表達(dá) IL7R, CCR7 和轉(zhuǎn)錄因子 TCF7，特異性表達(dá)的基因整體來說比其它類型的細(xì)胞少。而非初始 T 細(xì)胞具有很高的異質(zhì)性，其中一小群是記憶 T 細(xì)胞，大部分細(xì)胞是過渡性 CD8 T 細(xì)胞（transitional CD8 effector T），細(xì)胞毒性 CD8 T 細(xì)胞（cytotoxic CD8 effector T）和喪失功能的 CD8 T 細(xì)胞（dysfunctional CD8 T cells），高表達(dá) PD- 1 和 LAG3。這些細(xì)胞類群的邊界是模糊的，提示轉(zhuǎn)錄的梯度表達(dá)是造成 T 細(xì)胞異質(zhì)性的原因。CD4 T 細(xì)胞主要有高表達(dá) FOXP3 的 Treg，濾泡輔助 T 細(xì)胞（CXCL13 表達(dá)），以及一小群高表達(dá)免疫檢查點(diǎn)分子的細(xì)胞（dysfunctional CD4 T cells）。分析每名患者的免疫細(xì)胞組成，發(fā)現(xiàn)大部分 T 細(xì)胞類群在患者中都存在，但是病人之間不同細(xì)胞類群的豐度有很大差異。喪失功能的 CD8 T 細(xì)胞的負(fù)荷可能是黑色素瘤本質(zhì)的特征。

圖 病人間免疫微環(huán)境異質(zhì)性

通過分析 T 細(xì)胞的 TCR 序列，發(fā)現(xiàn)不同病人的 TCR 克隆型構(gòu)成差異較大。一些大的克隆中細(xì)胞類型也不同，主要表現(xiàn)為喪失功能的 CD8 T 細(xì)胞的富集和初始 T 細(xì)胞的缺失�；颊咧袉适Чδ艿� CD8 T 細(xì)胞的比例與 T 細(xì)胞的擴(kuò)增程度呈現(xiàn)正相關(guān)。通過計(jì)算每個(gè)細(xì)胞的增殖分?jǐn)?shù)，發(fā)現(xiàn)喪失功能的 CD8 T 細(xì)胞有高增殖細(xì)胞比例，比初始 T 細(xì)胞高出 10 倍。

圖 黑色素瘤中 T 細(xì)胞的克隆擴(kuò)增

3、免疫治療

靶向 PD-1/PD-L1 通路的免疫檢查點(diǎn)抑制劑的出現(xiàn)，給癌癥的臨床治療帶來了革命性的變化。然而 人們對(duì) PD-1 抗體的抑癌機(jī)制并不了解。其中一個(gè)關(guān)鍵的問題是 PD- 1 抗體的抑癌效果，究竟是依賴于在治療前就存在于腫瘤中的浸潤淋巴細(xì)胞的再激 活，還是治療之后，腫瘤外的殺傷 T 細(xì)胞進(jìn)入腫瘤？這個(gè)問題，目前也是不清楚的。來自斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的研究團(tuán)隊(duì)，從接受 PD- 1 抗體治療前后的基底細(xì)胞癌（BCC）或鱗狀細(xì)胞癌（SCC）患者身上采集了 79046 個(gè)細(xì)胞（包括癌細(xì)胞和各種免疫細(xì)胞），進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和 TCR 測(cè)序。基于單細(xì)胞 RNA 測(cè)序結(jié)果，細(xì)胞分成 19 個(gè)亞群。

本研究的重點(diǎn)是免疫細(xì)胞，尤其是浸潤性免疫細(xì)胞，以及治療前后的變化，以了解克隆性 T 細(xì)胞對(duì) PD- 1 抗體治療的反應(yīng)。因此研究人員把所有的 33106 個(gè)腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞做了個(gè)更細(xì)致的分類，包括表達(dá) CD4 的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞（Treg）細(xì)胞，濾泡輔助性 T（TFH）細(xì)胞，T 輔助細(xì)胞 17（TH17）細(xì)胞；以及表達(dá) CD8 的幼稚細(xì)胞，記憶 T 細(xì)胞，效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞，活化 T 細(xì)胞，慢性活化 / 耗竭 T 細(xì)胞，中度耗竭 / 活化細(xì)胞。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在 PD- 1 抗體治療之后，濾泡輔助性 T 細(xì)胞，以及活化，耗竭和耗竭 / 活化的 CD8 陽性 T 細(xì)胞的頻率增加，并且耗竭 T 細(xì)胞的克隆水平明 顯更高。更為讓研究人員感到意外的是，對(duì)于同一個(gè)患者而言，治療后記憶 T 細(xì)胞和效應(yīng) T 細(xì)胞頻繁轉(zhuǎn)換為活化狀態(tài)，但是治療前的耗竭 T 細(xì)胞卻沒有變成治療后的非耗竭表型。這表明，即使在 PD- 1 抗體治療后，已經(jīng)耗竭的腫瘤浸潤 T 細(xì)胞也很難變成活化狀態(tài)了。

圖 治療前后 T 細(xì)胞的狀態(tài)轉(zhuǎn)換。

此外，研究人員還觀察到一個(gè)有趣的現(xiàn)象，PD- 1 抗體治療后才出現(xiàn)的耗竭性 T 細(xì)胞表現(xiàn)出了新的 TCR 特異性。為了分析外周血中是否存在新發(fā)現(xiàn)的腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞，研究人員給患者的血液樣品做了 TCR 測(cè)序，發(fā)現(xiàn) 35.5% 新腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞可以在 PD- 1 抗體治療后的外周血中找到，而在治療前的外周血中只能找到 11.8% 的新腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞，不過治療前的腫瘤里面卻沒有新腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞。

圖 新發(fā)現(xiàn)的腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞在外周血中的比例

總的來說，與“冷”腫瘤相比，“熱”腫瘤之所以響應(yīng) PD- 1 抗體的治療，可能是由于“熱”腫瘤自身的特性，讓它能夠不斷吸引新 T 細(xì)胞進(jìn)入，而不是重新激活已有的腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞。這項(xiàng)研究讓我們對(duì)免疫檢查點(diǎn)抑制劑的作用機(jī)制有了新的認(rèn)知，這對(duì)臨床治療和療效的檢測(cè)都有一定的價(jià)值和意義。