單細(xì)胞 ATAC 測序

單細(xì)胞 ATAC 測序（Aaasay for transposase Accessible Chromatin with high throughput sequencing at the single cell level）翻譯成中文是在單細(xì)胞水平上通過高通量測序技術(shù)來研究染色質(zhì)開放程度（也叫染色質(zhì)的可及性）。染色質(zhì)開放程度（染色質(zhì)的可及性），反映了染色質(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性狀態(tài)，是研究基因表達(dá)調(diào)控的重要方向，在表觀遺傳圖譜繪制、細(xì)胞分化和發(fā)育及各類疾病的發(fā)生發(fā)展研究中具有重要的作用。

對(duì)染色質(zhì)可及性的研究是伴隨著對(duì)染色體結(jié)構(gòu)研究的發(fā)展逐漸興起的。1971 年，Mirsky 首先使用 DNase 來研究染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn) DNase 對(duì)于存在與染色中的 DNA 仍然可以切割，表現(xiàn)出染色中的 DNA 對(duì)于 DNase 的可及性。1975 年，Burkholder 和 Weaver 研究發(fā)現(xiàn) DNase I 對(duì)舒展?fàn)顟B(tài)的染色質(zhì)的消化速率高于對(duì)壓縮狀態(tài)的染色質(zhì)。同時(shí)指出 DNA 與染色質(zhì)蛋白的結(jié)合程度的差異與這兩種狀態(tài)下染色質(zhì)片段的功能相關(guān)。目前人們已經(jīng)知道雙螺旋的 DNA 與組蛋白結(jié)合后，會(huì)以染色質(zhì)或染色體的形式形成高級(jí)空間結(jié)構(gòu)。以人的基因組為例，每個(gè)組蛋白八聚體上纏繞有 146 個(gè)堿基對(duì)的 DNA。連接核小體與核小體之間的 DNA 序列稱為連接序列�；罴�(xì)胞中染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)總是處在動(dòng)態(tài)變化中，在不同類型的細(xì)胞中，或在不同的生理?xiàng)l件和外界刺激下，細(xì)胞核中染色中呈現(xiàn)不同的結(jié)構(gòu)和狀態(tài)。這些結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化的狀態(tài)表現(xiàn)形式之一就是染色質(zhì)可及性的變化。

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2015 年 4 月，Science 發(fā)表了 Multiplex single-cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing [1] 的文章。同年 7 月，Nature 發(fā)表了 Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation [2] 的文章。這兩篇論文先后提出利用單細(xì)胞 ATAC-seq 技術(shù)對(duì)染色質(zhì)可及性進(jìn)行檢測，探索細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，解決了以往存在的細(xì)胞異質(zhì)性難題，成為 ATAC-seq 技術(shù)的一大突破。其中，后者將 ATAC-seq 與 Fluidigm C1 單細(xì)胞平臺(tái)整合，利用微流控芯片完成捕獲、裂解、轉(zhuǎn)座、PCR 等實(shí)驗(yàn)過程，建立了自動(dòng)化的單細(xì)胞染色質(zhì)可及性圖譜研究方法。

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圖 ATAC-seq 與 Fluidigm C1 單細(xì)胞平臺(tái)整合的實(shí)驗(yàn)流程 ^[2]

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作者首先對(duì) 254 個(gè)類淋巴母細(xì)胞進(jìn)行了單細(xì)胞 ATAC 測序，將這些單細(xì)胞數(shù)據(jù)合并分析后得到的結(jié)果與群體細(xì)胞 DNase-seq 或 ATAC-seq 獲得的染色質(zhì)可及性圖譜具有很高的相關(guān)性，單細(xì)胞水平的數(shù)據(jù)再現(xiàn)了一些群體細(xì)胞 ATAC-seq 數(shù)據(jù)反映出的染色質(zhì)特征。

圖 單細(xì)胞 ATAC-seq 與常規(guī) ATAC-seq 的一致性 ^[2]

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為了進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可靠性，作者又用 scATAC-seq 的方法對(duì) ENCODE 細(xì)胞系，包括 H1 人類胚胎干細(xì)胞、K562 慢性粒細(xì)胞性白血病細(xì)胞、GM12878 類淋巴母細(xì)胞、V6.5 小鼠胚胎干細(xì)胞、EML1 細(xì)胞（小鼠造血祖細(xì)胞）、TF- 1 細(xì)胞（人類成紅細(xì)胞）、HL-60 cells（人類  promyeloblasts）和 BJ 成纖維細(xì)胞 HL-60 細(xì)胞進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在增殖細(xì)胞中，復(fù)制時(shí)序結(jié)構(gòu)域（replication timing domains）的染色質(zhì)可及性的變異性增加。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)不同的轉(zhuǎn)錄因子可以通過協(xié)同或者競爭性結(jié)合的作用促進(jìn)或者抑制染色質(zhì)可及性的可變性。通過此方法對(duì)作者對(duì)大量轉(zhuǎn)錄因子的 ChIP-seq 數(shù)據(jù)研究繪制出了轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用改變?nèi)旧�質(zhì)可接近性的圖譜。此外，還發(fā)現(xiàn)與高可變性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子的是細(xì)胞類型特異的，在單細(xì)胞中染色質(zhì)狀態(tài)與組蛋白修飾也與染色質(zhì)可接近性變化相關(guān)。

圖 轉(zhuǎn)錄因子通過協(xié)同或者競爭性結(jié)合作用促進(jìn)或者抑制染色質(zhì)可及性的可變性 ^[2]

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2018 年 10 月，10X Genomics 推出的 Chromium 單細(xì)胞 ATAC 解決方案提供了一種全面的、可擴(kuò)展的方法來研究分析單個(gè)樣本中成百上千個(gè)細(xì)胞中染色質(zhì)的開放情況。通過轉(zhuǎn)座酶對(duì)混合的細(xì)胞核懸液進(jìn)行核 DNA 的切割，然后使用微流控芯片將溶液中的細(xì)胞核包裹到油滴中，形成納米級(jí)的凝膠珠狀乳狀液（GEMs）。采用 10X 條形碼，對(duì)每個(gè)細(xì)胞核切割的 DNA 加上條形碼。通過文庫構(gòu)建，測序，根據(jù) 10X 條形碼將測序得到的序列關(guān)聯(lián)到每個(gè)單獨(dú)的細(xì)胞核上。

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1、轉(zhuǎn)座酶切割核 DNA

細(xì)胞核懸浮液在包括轉(zhuǎn)座酶的混合液中孵育。轉(zhuǎn)座酶進(jìn)入細(xì)胞核，優(yōu)先在染色質(zhì)的開放區(qū)域?qū)?DNA 片段化。同時(shí)，將測序接頭序列添加到片段化的 DNA 片段的末端。

圖 轉(zhuǎn)座酶切割 DNA 示意圖

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2、GEM 生成及 Barcode 添加

在 Chromium Next GEM Chip H 芯片上，使包含有 barcode 的凝膠珠，轉(zhuǎn)座酶切割后的細(xì)胞核，混合液（包括 ATAC buffer 和 ATAC 酶），以及油滴進(jìn)行混合，生成 GEMs。為了達(dá)到每個(gè)油滴中包含有單個(gè)細(xì)胞核，需要對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行有限稀釋，保證生成的大多數(shù) GEMs(~90-99%) 不包含細(xì)胞核，而其余的為包含單個(gè)細(xì)胞核 GEMs。

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GEMs 生成后，凝膠珠會(huì)溶解釋放出含有（i) Illumina P5 序列、(ii) 16nt 10X 條形碼序列和（iii) Read 1 (Read 1N) 序列的寡核苷酸。這些核苷酸序列會(huì)于片段化的 DNA，以及混合液進(jìn)行混合。后續(xù)經(jīng)過熱循環(huán)后生成含有 10X barcode 的單鏈 DNA。經(jīng)過孵育后，對(duì) GEMs 進(jìn)行破油處理，所有 GEMs 中的含有 10X barcode 的單鏈 DNA 混合在一起，并進(jìn)行回收。

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3、破油后的純化

使用硅烷磁珠清除破油反應(yīng)混合物中殘留的生化試劑。固相可逆固定（SPRI) 珠子用于從樣本中消除未使用的 10X 條形碼。
 

4、測序文庫的構(gòu)建及質(zhì)檢

通過 PCR 將 P7 接頭以及樣本的標(biāo)簽（Index N）添加到文庫的兩端，形成包含有 P5 和 P7 接頭序列的文庫，用于 Illumina 橋式 PCR 擴(kuò)增。

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文庫結(jié)構(gòu)

圖  ATAC 文庫組成示意圖

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通過 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 對(duì)文庫進(jìn)行質(zhì)檢，結(jié)果如下：

圖 Agilent TapeStation High Sensitivity D1000 ScreenTape 文庫質(zhì)檢結(jié)果

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或者用  Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 來檢測片段大小，結(jié)果如下：

圖 Agilent Bioanalyzer High Sensitivity DNA chip 質(zhì)檢結(jié)果

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備注：

a、橫坐標(biāo)表示文庫的片段程度，其中 0 代表核小體 free 的峰。1 代表包含有一個(gè)核小體的峰；2 代表包含有 2 個(gè)核小體的峰；以此類推。

b、核小體是由 DNA 和組蛋白形成的染色質(zhì)基本結(jié)構(gòu)單位。每個(gè)核小體由 146bp 的 DNA 纏繞組蛋白八聚體 1.75 圈形成。核小體核心顆粒之間通過 50bp 左右的連接 DNA 相連。加上兩端的 P5,P7 接頭，barcode，sample index，R1N 序列，長度大概如下：核小體 free 的峰長度 200 多 bp；1 個(gè)核小體的峰約為 300 多 bp；2 個(gè)核小體的峰約為 500bp，以此類推。

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建議測序深度及參數(shù)

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▲流程精簡時(shí)效快： 可檢測單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)域中的開放性染色質(zhì)。

▲通量高： 每個(gè)通道 500-10000 個(gè)細(xì)胞核。

▲效率高： 細(xì)胞核捕獲率高達(dá) 65%。

▲適用范圍廣： 經(jīng)驗(yàn)證適用于原代細(xì)胞，凍存細(xì)胞，新鮮組織等。

▲信息分析： 獲取信息量大，可精細(xì)化分析。

▲同一份樣本可實(shí)現(xiàn)單細(xì)胞 ATAC、mRNA、TCR/BCR 同時(shí)測序，并整合數(shù)據(jù)。

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▲類型： 新鮮組織，原代細(xì)胞，細(xì)胞系等。

▲來源： 血液提取、磁珠富集、流式富集、組織解離等。

▲樣本量及其它質(zhì)控要求：

▲樣本的保存與運(yùn)輸：

（1）細(xì)胞懸液：建議現(xiàn)場制備，如要運(yùn)輸，建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。

（2）血液：EDTA 抗凝的全血，4°C 運(yùn)輸，2 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室；或提取 PBMC 后凍存，干冰運(yùn)輸。

（3）組織：建議使用伯豪生物自主研發(fā)的單細(xì)胞 ATAC-seq 組織保護(hù)液，4°C 運(yùn)輸，48 小時(shí)內(nèi)送達(dá)伯豪生物實(shí)驗(yàn)室。

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▲干細(xì)胞 / 發(fā)育生物學(xué)

▲腫瘤學(xué)

▲免疫學(xué)

▲神經(jīng)科學(xué)

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1、The Cell Ranger ATAC 分析結(jié)果

10X genomics 官方的 Cell Ranger ATAC 流程會(huì)輸出一個(gè) HTML 文件，其中包含數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果和初步的分析結(jié)果。

a、基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)（細(xì)胞數(shù)，每個(gè)細(xì)胞測到的數(shù)據(jù)的中位值，比對(duì)到 peaks 上的數(shù)據(jù)的比例等）

圖   單細(xì)胞 ATAC 基本數(shù)據(jù)展示

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b、插入片段長度統(tǒng)計(jì)（包括核小體 free 的比例，單核小體的比例）

圖 插入片段長度統(tǒng)計(jì)（單細(xì)胞 ATAC 測序數(shù)據(jù)分析）

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c、細(xì)胞聚類結(jié)果

圖 細(xì)胞聚類結(jié)果（單細(xì)胞 ATAC 測序數(shù)據(jù)分析）

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2、Loupe Cell Browser 展示結(jié)果

Loupe Cell Browser 是一個(gè)適用于 Windows 和 MacOS 的桌面應(yīng)用程序，它可以快速、輕松地可視化和分析 10X Chromium 單細(xì)胞 ATAC 數(shù)據(jù)。它在尋找顯著的峰和識(shí)別轉(zhuǎn)錄因子基序、識(shí)別細(xì)胞類型、比較各組細(xì)胞之間的染色質(zhì)可及性以及探索細(xì)胞簇內(nèi)的子結(jié)構(gòu)方面進(jìn)行了優(yōu)化。

圖 Loupe Cell Browser 展示細(xì)胞分群及 peaks

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基于 RNA 的細(xì)胞注釋結(jié)果，對(duì) ATAC 的細(xì)胞類型進(jìn)行打分注釋。

圖 單細(xì)胞 ATAC 測序細(xì)胞類群注釋結(jié)果

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1、干細(xì)胞分化優(yōu)質(zhì)供應(yīng)商。

2、腫瘤異質(zhì)性

3、免疫學(xué)

4、神經(jīng)科學(xué)

[1] Cusanovich DA, Daza R, Adey A, et al. Multiplex single cell profiling of chromatin accessibility by combinatorial cellular indexing. Science 2015, 348(6237):910-4.

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[3] Buenrostro JD, Corces MR, Lareau CA, et al. Integrated Single-Cell Analysis Maps the Continuous Regulatory Landscape of Human Hematopoietic Differentiation. Cell 2018, 173(6):1535-1548.

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