4D蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)

         離子淌度概念的引入使得蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)入了4D新時(shí)代。4D蛋白質(zhì)組學(xué)是在3D基礎(chǔ)之上增加了第四個(gè)維度--離子淌度（Ion mobility）的分離，進(jìn)而大幅度的提高掃描速度和檢測靈敏度，帶來蛋白質(zhì)組學(xué)在鑒定深度、檢測周期、定量準(zhǔn)確性等性能的全面提升。離子淌度，也叫離子遷移譜，即 ion mobility spectrometry（IMS），其核心原理是電場驅(qū)動下離子在氣體阻尼環(huán)境中的遷移速率差異，能夠根據(jù)離子的尺寸、形狀和電荷進(jìn)行氣相分離，從而達(dá)到在離子進(jìn)入MS前對雜離子進(jìn)行預(yù)分離的效果，即為“離子清洗”。

 

         離子淌度與質(zhì)譜儀聯(lián)用后，一次分析就能夠同時(shí)提供多個(gè)維度信息，包括精確質(zhì)量數(shù)（MS1）、二級碎片譜圖（MS/MS）和碰撞截面積（CCS）數(shù)據(jù)等，有效提升了對復(fù)雜生物樣品的定性和定量分析能力。

 

根據(jù)工作原理的差異，離子淌度又分為幾個(gè)主要技術(shù)方案：

 

1. 捕集離子淌度質(zhì)譜 (Trapped Ion Mobility Spectrometry, TIMS)

2. 高場不對稱波形離子遷移譜 (Field asymmetric ionmobility spectrometry, FAIMS)

3. 漂移時(shí)間離子遷移譜 (Drift-time ionmobility spectrometry, DTIMS)

4. 吸入離子遷移譜(Aspiration ion mobility spectrometry, AIMS)

5. 行波離子遷移譜(Travelling wave ion mobility spectrometry,TWIMS)  T-Wave®

 

|   華盈生物4D蛋白質(zhì)組學(xué)服務(wù)

      目前TIMS技術(shù)和FAIMS技術(shù)分別被Bruker和Thermo Fisher公司運(yùn)用到蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的質(zhì)譜儀開發(fā)中，分別命名為Exploris 480+FAIMS pro和timsTOF Pro。華盈生物同時(shí)擁有該兩款主流的質(zhì)譜儀，可根據(jù)實(shí)際應(yīng)用場景為客戶提供匹配的4D質(zhì)譜儀和對應(yīng)的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測技術(shù)。

 

 

 

       經(jīng)過大量項(xiàng)目測試發(fā)現(xiàn)：TimsTOF Pro具有上樣量少，掃描速度快的特點(diǎn)，對于微量樣品的檢測優(yōu)勢尤為突出，特別適用于磷酸化等修飾組、穿刺樣本、流式分選細(xì)胞等微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析項(xiàng)目。480+FAIMS pro分辨率更高，可進(jìn)行TMT 6/10/16標(biāo)的標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組檢測。同時(shí)，480+FAIMS pro鑒定深度也相對更高，特別適用于組織 / 器官蛋白組圖譜構(gòu)建工作，是多組學(xué)聯(lián)合研究的推薦技術(shù)。

 

 

      因此，對于有深度蛋白質(zhì)組研究需求的合作者，華盈生物將充分結(jié)合兩款質(zhì)譜儀的特點(diǎn)以及專為4D質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)研發(fā)的樣品前處理體系，為合作者提供合理的實(shí)驗(yàn)方案。就華盈生物目前定量蛋白質(zhì)組學(xué)的技術(shù)體系來說，Label Free、DIA、TMT、PRM和修飾蛋白組均可以進(jìn)行升級，分別在兩款4D質(zhì)譜儀上完成深度蛋白質(zhì)組覆蓋檢測。

 

|   項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)

      華盈生物已經(jīng)完成了上百種類型樣品的定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。蛋白質(zhì)組表達(dá)具有時(shí)空差異性，不同樣本的蛋白譜各有特點(diǎn)，下圖色塊大小代表的是華盈生物鑒定的不同樣本的蛋白譜數(shù)量差異。

 

|   經(jīng)典案例：timsTOF 4D質(zhì)譜技術(shù)優(yōu)勢

 

 

 

 

      該文獻(xiàn)是德國馬普生化研究所所長、世界著名蛋白質(zhì)組學(xué)專家 Matthias Mann 教授于2018年發(fā)表于蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域頂級期刊 MCP的一篇關(guān)于4D質(zhì)譜技術(shù)介紹的文章。該文章介紹了timsTOF Pro質(zhì)譜系統(tǒng)，能實(shí)現(xiàn)更快速度、更高靈敏度、更強(qiáng)大的4D蛋白質(zhì)組學(xué)分析，展現(xiàn)了其在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的強(qiáng)大功能和廣泛應(yīng)用前景。

 

      作者結(jié)合一定的算法對肽段離子從m/z和離子淌度（ion mobility）兩個(gè)維度進(jìn)行分析鑒定。從結(jié)果中我們可以看到，在m/z維度上不能分離的肽段離子，在離子淌度維度上能夠被清晰的分離（圖1，縱坐標(biāo)）。

 

圖1. 肽段離子的捕獲離子淌度分離

 

      此外，文章展示了timsTOF Pro的另一個(gè)技術(shù)，即平行累積連續(xù)碎裂PASEF（Parallel Accumulation Serial Fragmentation）（圖2）。該技術(shù)運(yùn)用雙TIMS，實(shí)現(xiàn)離子在第一個(gè)TIMS中進(jìn)行累積，然后在第二個(gè)TIMS中根據(jù)淌度進(jìn)行分離，經(jīng)過分離后的離子進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)。并且，當(dāng)?shù)诙�個(gè)TIMS進(jìn)行分離時(shí)，第一個(gè)TIMS也同時(shí)在平行地累積離子，這樣可以實(shí)現(xiàn)近乎100％的離子利用率。

 

 

圖2. timsTOF Pro上實(shí)現(xiàn)同步累積連續(xù)碎裂（PASEF）

 

      為了分析4D質(zhì)譜對蛋白定量的準(zhǔn)確性，研究者從皮爾森相關(guān)系數(shù)、中位數(shù)變異系數(shù)、缺失值和定量準(zhǔn)確度這四個(gè)統(tǒng)計(jì)角度進(jìn)行了研究。在2h梯度、4次技術(shù)重復(fù)的條件下平均鑒定到5575個(gè)蛋白，結(jié)果顯示蛋白信號值的皮爾森相關(guān)系數(shù)為0.979，表明實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性非常好（圖3A）。MaxLFQ歸一化以后，中位數(shù)變異系數(shù)為7.2%（圖3B）。進(jìn)一步，研究者發(fā)現(xiàn)4D質(zhì)譜技術(shù)能夠顯著降低label-free缺失值的問題（圖3C）。同時(shí)，研究者將Hela和大腸桿菌胰酶消化后的肽段混合并進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果顯示95%的蛋白是能準(zhǔn)確定量，只有1.3%的蛋白被錯(cuò)誤分類。展示了該方法高水平的定量準(zhǔn)確性（圖3D）。

 

 

圖3. labelfree蛋白組定量

 

      為了驗(yàn)證4D蛋白組定量檢測速度和通量，研究者采用了100ng、50ng、10ng的Hela細(xì)胞樣品并在1h梯度和0.5h梯度條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示，100ng、50ng、10ng的樣品量在1h的條件下分別可以鑒定到4513、4215、2723個(gè)蛋白（圖4A）。30分鐘內(nèi)10ng的Hela細(xì)胞能夠鑒定到2100個(gè)蛋白（圖4B）。這個(gè)結(jié)果表明4D質(zhì)譜非常適用于快速且高靈敏度的蛋白質(zhì)組學(xué)應(yīng)用。

 

 

圖4. 4D質(zhì)譜分析Hela蛋白組速度和靈敏度

 

      該文章詳細(xì)闡述了基于離子淌度的4D蛋白質(zhì)組學(xué)，為蛋白質(zhì)組學(xué)定量的準(zhǔn)確性和靈敏度帶來了革命性提升，并且極大的減少檢測時(shí)間和樣品量。在提高掃描速度的同時(shí)，依然保持超高分辨率，這些獨(dú)特的性能，使其成為蛋白組學(xué)復(fù)雜樣本深入研究的利器。

 

|   相關(guān)文獻(xiàn)

[1]. Sun J, Han S, Ma L, et al. Synergistically Bifunctional Paramagnetic Separation Enables Efficient Isolation of Urine Extracellular Vesicles and Downstream Phosphoproteomic Analysis. ACS Appl Mater Interfaces. 2021 Jan 27;13(3):3622-3630.

[2]. Yu F, et al. Fast Quantitative Analysis of timsTOF PASEF Data with MSFragger and IonQuant. Mol Cell Proteomics. 2020 Sep;19(9):1575-1585.

[3]. Bekker-Jensen DB, et al. A Compact Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer with FAIMS Interface Improves Proteome Coverage in Short LC Gradients. Mol Cell Proteomics. 2020 Apr;19(4):716-729.

[4]. Tian W, et al. Immune suppression in the early stage of COVID-19 disease. Nat Commun. 2020 Nov 17;11(1):5859.

[5]. Florian Meier et al. diaPASEF: parallel accumulation-serial fragmentation combined with data-independent acquisition. Nat Methods. 2020 Dec;17(12):1229-1236.

[6]. Meier F, et al. Online Parallel Accumulation-Serial Fragmentation (PASEF) with a Novel Trapped Ion Mobility Mass Spectrometer. Mol Cell Proteomics. 2018 Dec;17(12):2534-2545.