TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)

       TMT是由美國Thermo Fisher 公司研發(fā)的一種多肽體外標(biāo)記技術(shù)，最多可進(jìn)行18例樣本的蛋白質(zhì)同批定量分析。TMT試劑由肽結(jié)合基團(tuán)、平衡基團(tuán)和報(bào)告基團(tuán)三部分組成，可形成18 種等量異位標(biāo)簽。具體實(shí)驗(yàn)流程及原理如下圖：以5例樣品的TMT標(biāo)記定量檢測為例。在實(shí)驗(yàn)過程中將5例不同樣品分別酶解成多肽片段→分別標(biāo)記5種同位素標(biāo)簽→將5例標(biāo)記好的多肽樣品混合成1例總樣品→進(jìn)行HPLC分級(jí)（一般為10-15級(jí)）→分級(jí)后的多肽組分依次進(jìn)入LC-MS/MS分析系統(tǒng)→二級(jí)MS階段TMT平衡基團(tuán)發(fā)生中性丟失，在低質(zhì)量區(qū)產(chǎn)生多個(gè)報(bào)告離子→計(jì)算各報(bào)告離子峰面積，獲得同一肽段不同樣品間的相對(duì)豐度差異比值→加權(quán)計(jì)算肽段豐度獲得總蛋白質(zhì)相對(duì)定量值。

|   TMT標(biāo)記定量技術(shù)優(yōu)勢

       從TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)基本原理和實(shí)驗(yàn)流程中我們可以看出，該技術(shù)將不同的樣本分別標(biāo)記獨(dú)立的TMT標(biāo)簽，再等量混合成1例pool樣進(jìn)入質(zhì)譜分析。這種設(shè)計(jì)保證了所有樣品均一性地經(jīng)過質(zhì)譜檢測，從而防止了樣品依次上樣在質(zhì)譜儀波動(dòng)期引入的樣品間系統(tǒng)誤差。因此，一般研究認(rèn)為TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)相較于非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)，在蛋白質(zhì)組定量比較方面更加準(zhǔn)確。

      同時(shí)，由于TMT實(shí)驗(yàn)將pool樣進(jìn)行HPLC分級(jí)處理，進(jìn)行多次質(zhì)譜進(jìn)樣，這樣的實(shí)驗(yàn)流程不僅將進(jìn)入質(zhì)譜中樣品的復(fù)雜度顯著降低，從而減少了背景干擾，提高蛋白檢出率。同時(shí)，不同HPLC組分中會(huì)保留同一蛋白多肽，經(jīng)過質(zhì)譜重復(fù)鑒定，在定性和定量方面均可提高蛋白質(zhì)組學(xué)的數(shù)據(jù)準(zhǔn)確度，也提高了蛋白質(zhì)組的鑒定深度。因此，TMT標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)于蛋白質(zhì)組學(xué)深度檢測需求的研究尤為適用。

|   主要儀器設(shè)備

|   項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)

      華盈生物已經(jīng)完成上百種類型樣品的定量蛋白質(zhì)組學(xué)檢測，蛋白質(zhì)組表達(dá)具有時(shí)空差異性，不同樣本的蛋白譜各有特點(diǎn)，下圖色塊大小代表的是不同樣本鑒定的蛋白數(shù)量差異。

|   樣品要求

|   應(yīng)用方向

●   發(fā)病機(jī)理研究

●   藥物靶點(diǎn)研究

●   疾病標(biāo)志物篩選

●   植物品種改良

●   工程菌改造

●   特殊功能蛋白質(zhì)篩選

|   經(jīng)典案例

TMT技術(shù)發(fā)現(xiàn)脂肪代謝紊亂底層機(jī)理

2017年5月美國學(xué)者Pamir N等運(yùn)用TMT標(biāo)記技術(shù)成功完成了20例小鼠脂肪組織蛋白質(zhì)組定量比較。相關(guān)研究工作發(fā)表在蛋白質(zhì)組學(xué)代表性雜志《Molecular & Cellular Proteomics》上（PMID: 28325852）。該研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)巧妙，突破了iTRAQ和TMT等體外標(biāo)記蛋白組學(xué)技術(shù)在同位素標(biāo)簽數(shù)量上的限制。

TMT蛋白質(zhì)組學(xué)定量研究實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

研究人員將8周齡的20只小鼠處理分成四組（每組5只小鼠）：分別低脂喂養(yǎng)8周和18周，高脂喂養(yǎng)8周和18周。分別取各小鼠附睪脂肪組織進(jìn)行3組TMT蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析，共計(jì)20例樣品，通過3套TMT試劑“搭橋”方案完成了蛋白質(zhì)組學(xué)定量分析。將3組質(zhì)譜數(shù)據(jù)校準(zhǔn)后進(jìn)行組間蛋白譜比較，獲得衰老（aging）和高脂飲食（HF）調(diào)控的脂肪組織特征蛋白譜，重新認(rèn)識(shí)衰老與高脂飲食誘導(dǎo)的代謝紊亂疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見圖1。

圖1.多樣本TMT蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)路線

高脂飲食易造成代謝紊亂

經(jīng)過18個(gè)月高脂飲食喂養(yǎng)，小鼠出現(xiàn)了代謝狀態(tài)系統(tǒng)性紊亂，隨時(shí)間增長逐漸加劇。在低脂狀態(tài)下，衰老是引起代謝紊亂主要因素，但紊亂程度較高脂環(huán)境要輕，見圖2。

圖2.高脂飲食和衰老造成糖脂代謝紊亂

蛋白質(zhì)組改變伴隨代謝紊亂發(fā)生

通過對(duì)比分析組間定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的差異，研究人員發(fā)現(xiàn)衰老是引起蛋白質(zhì)組變化的重要因素。而在高脂環(huán)境下，衰老對(duì)于蛋白質(zhì)組的調(diào)變影響將被放大，表現(xiàn)為代謝相關(guān)差異蛋白顯著增多。

圖3.高脂飲食和衰老造成蛋白質(zhì)組顯著調(diào)變

      TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)系統(tǒng)比較了衰老（Aging）和高脂飲食（HF）各自調(diào)控的脂肪組織特征蛋白譜，發(fā)現(xiàn)：低脂飲食條件下，衰老因素主要通過調(diào)控脂代謝、氨基酸代謝相關(guān)蛋白群改變引發(fā)代謝紊亂。而在高脂環(huán)境下，衰老對(duì)免疫系統(tǒng)、補(bǔ)體激活、基質(zhì)重塑等蛋白群又產(chǎn)生了新的影響，造成了更嚴(yán)重的代謝紊亂發(fā)生，見如圖4。

圖4.差異蛋白譜互作網(wǎng)絡(luò)分析

小結(jié)

通過本文可以看出，蛋白質(zhì)組學(xué)研究具有很大的發(fā)展空間，可以填補(bǔ)很多研究知識(shí)上的空白。良好的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)可以突破技術(shù)限制，并讓實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有更強(qiáng)的說服力。

|   相關(guān)文獻(xiàn)

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