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生物研發(fā)服務(wù)

SELDI蛋白質(zhì)芯片實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

SELDI-TOF-MS

表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術(shù)也即蛋白指紋圖譜技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)。

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表面增強(qiáng)激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜（SELDI-TOF-MS）技術(shù)也即蛋白指紋圖譜技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的實(shí)驗(yàn)室診斷新技術(shù)。近年來，該技術(shù)在差異表達(dá)蛋白質(zhì)組學(xué)，蛋白質(zhì)相互作用及疾病檢測(cè)方面得到了廣泛的應(yīng)用，尤其適合多肽及低分子量蛋白質(zhì)譜分析的研。

一、實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)

以蛋白質(zhì)芯片SELDI系統(tǒng)為載體，通過對(duì)目標(biāo)疾病組及正常對(duì)照組之間進(jìn)行鑒定，以期找到能夠區(qū)分不同組別的差異峰，并通過對(duì)差異峰進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定，期望找到與目標(biāo)疾病密切關(guān)聯(lián)的基因/蛋白。

二、實(shí)驗(yàn)方案

2.1．樣品準(zhǔn)備

采集臨床病人及正常人血清，并做好臨床資料的收集。采樣數(shù)量大于100例，一般情況下病人樣品與正常人樣本相等，也可以病人樣品略多于正常人。

采集患者術(shù)前血和正常對(duì)照外周靜脈血立即放入4℃冰箱，過夜后3000r/min離心15分鐘，取血清，20ul一管分裝后置于-80℃冰箱保存。

2.2. 芯片實(shí)驗(yàn)及進(jìn)度

芯片采用伯樂公司的WCX2蛋白質(zhì)芯片。分為三個(gè)階段：

預(yù)實(shí)驗(yàn)階段：對(duì)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行摸索，確定最佳的實(shí)驗(yàn)參數(shù)，需花時(shí)2周左右；

正式實(shí)驗(yàn)階段：對(duì)樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，得到質(zhì)譜圖，需花時(shí)4周左右；

數(shù)據(jù)分析階段：對(duì)實(shí)驗(yàn)得出的原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，分析項(xiàng)目包括原始數(shù)據(jù)的分布情況分析、差異峰的篩選、聚類分析、主成分分析（PCA）、疾病預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建及差異峰所對(duì)應(yīng)的蛋白的生物信息學(xué)鑒定六個(gè)項(xiàng)目，以充分挖掘原始數(shù)據(jù)中有價(jià)值的信息。花時(shí)2周左右。

2.3. 蛋白質(zhì)鑒定

對(duì)差異峰所對(duì)應(yīng)的蛋白(預(yù)測(cè)）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。采用的實(shí)驗(yàn)方法為Western鑒定。我們對(duì)差異蛋白進(jìn)行精選，挑選兩個(gè)蛋白進(jìn)行western實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)中用到的蛋白質(zhì)抗體由客戶提供。另外，需要提出的是，由于實(shí)驗(yàn)具有一定有不確性定，所以我們不保證該實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。但如果一旦發(fā)現(xiàn)目標(biāo)蛋白，這結(jié)果將是一篇很好的SCI論文。時(shí)間為1-2個(gè)月

三、實(shí)驗(yàn)步驟

SELDI蛋白質(zhì)芯片實(shí)驗(yàn)包括四個(gè)步驟：

步驟一：芯片類型的選擇

蛋白質(zhì)芯片提供了多種色譜的功能，包括親水、疏水、陽離子交換、陰離子交換以及金屬親和表面等。此外，通過共價(jià)偶聯(lián)選定的蛋白質(zhì)或者其他目標(biāo)分子，可以對(duì)芯片表面實(shí)現(xiàn)預(yù)活化，從而設(shè)計(jì)出具有更高針對(duì)性、特異性的芯片。

步驟二：上樣

血清、細(xì)胞或者組織的裂解液、尿、腦脊液，或者其他蛋白質(zhì)勻漿液等復(fù)雜的生物學(xué)樣品——包括那些含有高濃度鹽離子和去垢劑的樣品——都可以直接上樣于SLEDI蛋白質(zhì)芯片表面。樣品通過手工加樣或者自動(dòng)上樣儀進(jìn)行點(diǎn)樣。復(fù)雜蛋白質(zhì)樣品中的一個(gè)特定亞群將通過簡(jiǎn)單的化學(xué)作用或者蛋白質(zhì)相互作用被芯片捕獲。

步驟三：未結(jié)合成分的洗脫

孵育后，未結(jié)合的蛋白和其他成分從芯片表面洗脫掉。只有那些特異性結(jié)合的蛋白質(zhì)才保留下來用于進(jìn)一步的分析。這種選擇性的洗脫進(jìn)一步選取基于芯片特色的蛋白質(zhì)集合。

步驟四：在SELDI蛋白質(zhì)閱讀機(jī)上進(jìn)行分析

在洗脫步驟之后，點(diǎn)加上含有能量吸收分子（EAM）的有機(jī)溶液。EAMs對(duì)樣品的離子化起關(guān)鍵作用。在蛋白質(zhì)溶解到含有EAM的溶液之后，溶液揮發(fā)掉，在芯片表面形成蛋白質(zhì)和EAMs的共結(jié)晶。

芯片在SELDI閱讀機(jī)上進(jìn)行分析，后者是一種時(shí)間飛行質(zhì)譜。芯片閱讀機(jī)內(nèi)有一個(gè)氮源的激光器，導(dǎo)致離子化和解吸附過程的產(chǎn)生。激光能量誘導(dǎo)蛋白質(zhì)離子化以及從晶體態(tài)到氣態(tài)的轉(zhuǎn)變。

一旦進(jìn)入到氣態(tài)，帶電蛋白質(zhì)分子在一個(gè)分離電壓作用下迅速地運(yùn)動(dòng)，或稱“飛行”。分離電壓對(duì)樣品中所有的分子具有相同的作用，使之表現(xiàn)出基于分子量差別的不同飛行時(shí)間。SELDI閱讀機(jī)記錄下這些飛行時(shí)間，換算成分子量。

四、數(shù)據(jù)分析方案

1、數(shù)據(jù)預(yù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)相關(guān)軟件處理，設(shè)置第一步S/N>5,第二步S/N>2，得到peak cluster數(shù)據(jù)。以此數(shù)據(jù)進(jìn)行了后續(xù)的分析。

2、差異peak篩選

利用wilcoxon sum rank test統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，我們檢驗(yàn)了每個(gè)peak在組份中中值的差異。

peak_index	M/Z	AVG_case	STD_case	AVG_control	STD_control	p-value
M2047_35	2047.35	1.1237	1.9139	4.2743	3.1970	0.0000
…	…	…	…	…	…	…

3、層次聚類

對(duì)所有表達(dá)差異峰（peak）進(jìn)行聚類，確定差異峰及不同樣品之間的互作關(guān)系，一般認(rèn)為在聚類圖上距離越近的樣品或差異峰之間的關(guān)系越密切。

4、PCA分析（principal component analysis）

通過對(duì)有顯著性差異的peak做PCA分析，將樣品的特征量壓縮，在低維度空間反映樣品之間的關(guān)系。用score plot展示PCA分析結(jié)果.

5、疾病預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建

利用決策樹，Bayesian network, ANN及SVM等機(jī)器學(xué)習(xí)語言對(duì)芯片結(jié)果進(jìn)行預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建，將部分芯片數(shù)據(jù)拿來做預(yù)測(cè)模型，然后部分芯片數(shù)據(jù)作為測(cè)試數(shù)據(jù)集（獨(dú)立樣本）來驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性。

目的在于利用實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來篩選出一批靶標(biāo)基因，并以此構(gòu)建模型，以進(jìn)行早期診斷、疾病預(yù)測(cè)和預(yù)后分析。

6、差異峰關(guān)聯(lián)蛋白鑒定

為了進(jìn)一步的對(duì)其進(jìn)行鑒定，需要找到這些差異峰(peak)對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)或基因。為了解決這個(gè)問題，我們根據(jù)相關(guān)SCI文獻(xiàn)的算法構(gòu)建一個(gè)軟件peak2gene，用于對(duì)實(shí)驗(yàn)中找到的差異峰所對(duì)應(yīng)的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)鑒定。以便于客戶進(jìn)一步的利用RT-PCR，western等實(shí)驗(yàn)方法對(duì)感興趣的目標(biāo)蛋白進(jìn)行鑒定。

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上海敏芯信息科技有限公司

上海敏芯信息科技有限公司成立于2006年10月，是國(guó)內(nèi)知名的生物信息學(xué)服務(wù)提供商。隨著業(yè)務(wù)擴(kuò)展，公司已經(jīng)發(fā)展成為國(guó)內(nèi)第一家專業(yè)提供系統(tǒng)生物學(xué)服務(wù)的高科技企業(yè)，提供包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)相關(guān)的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)檢測(cè)、數(shù)據(jù)分析、結(jié)果驗(yàn)證及論文修改的全面解決方案。公司已獲得國(guó)家及上海市中小企業(yè)創(chuàng)新基金、上海市科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃、上海市大學(xué)生創(chuàng)業(yè)基金、上海市專利試點(diǎn)企業(yè)、上海市技術(shù)成果轉(zhuǎn)化認(rèn)證、上海市楊浦區(qū)人才資助資金等多項(xiàng)國(guó)家及省部級(jí)獎(jiǎng)勵(lì)。

具體業(yè)務(wù)包括：

-基因芯片：表達(dá)譜芯片、miRNA芯片、SNP芯片、甲基化芯片、Exon芯片、Tilling芯片、lncRNA芯片等實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

- 高通量測(cè)序：miRNA測(cè)序、mRNA測(cè)序、基因組重測(cè)序、甲基化測(cè)序、ChIP-Seq等實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

-蛋白質(zhì)組學(xué)：蛋白質(zhì)芯片（SELDI）、細(xì)胞因子芯片、ITRAQ、Shotgun Proteomics、DIGE-2D等

- 代謝組學(xué)：液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）、氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）及核磁共振（NMR）的實(shí)驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析

- 文獻(xiàn)挖掘：提供基于pubmed數(shù)據(jù)庫(kù)的關(guān)鍵詞搜索服務(wù)

- 生物信息培訓(xùn)：定期舉辦綜合性生物信息培訓(xùn)班，并提供上門培訓(xùn)服務(wù)及隨到隨學(xué)班

u 專利代理：提供生命科學(xué)領(lǐng)域的專利寫作、專利潤(rùn)色及專利申請(qǐng)服務(wù)

- 實(shí)驗(yàn)服務(wù)：引物設(shè)計(jì)、RT-PCR、3730測(cè)序、Western Blot、2D-MS等

目前，公司國(guó)內(nèi)外客戶已超過500家，合作發(fā)表了50多篇高影響因子的SCI(影響因子累計(jì)超過100分)，并參與多項(xiàng)國(guó)家科研項(xiàng)目的申請(qǐng)與實(shí)施。

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