基因表達(dá)具有時(shí)間和空間的特異性，通過對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的樣本取材，使用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)能夠解析時(shí)間維度上細(xì)胞類型和基因表達(dá)的變化過程。然而單細(xì)胞測(cè)序?qū)嶒?yàn)的前提是組織必須通過機(jī)械分離或酶解消化成單細(xì)胞懸液，此過程不可避免的丟失了組織中細(xì)胞所處的原始位置信息，也導(dǎo)致了細(xì)胞間的通訊網(wǎng)絡(luò)被打破，這使我們難以獲得組織中不同區(qū)域的細(xì)胞構(gòu)成和基因表達(dá)狀態(tài)，以及不同功能區(qū)之間的基因差異表達(dá)等信息�，F(xiàn)有的原位表達(dá)圖譜主要是通過報(bào)告基因或原位雜交等技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，但是這些方法實(shí)現(xiàn)比較困難，并且通量低，限制了多樣本、高時(shí)效的應(yīng)用。而空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)則可以高 效的檢測(cè)組織中空間原始位置上的基因表達(dá)模式。
▲圖 空間轉(zhuǎn)錄組被評(píng)為 2020 年度技術(shù)
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空間轉(zhuǎn)錄組（Spatial Transcriptomics）就是將基因的表達(dá)情況與關(guān)注的組織切片的免疫化學(xué)染色圖像進(jìn)行整合，從而將組織內(nèi)不同細(xì)胞的基因表達(dá)信息定位到組織的原始空間位置上去，進(jìn)而直接觀測(cè)組織中不同部位功能區(qū)基因表達(dá)的差異�？臻g轉(zhuǎn)錄組技術(shù)利用了常規(guī)的原位技術(shù)和組學(xué)技術(shù)兩方面的優(yōu)勢(shì)。實(shí)際上空間轉(zhuǎn)錄組已不是新名詞，2016 年 Joakim Lundeberg 的 Spatial Transcriptomics 技術(shù)在 Science 上發(fā)表，2017 年景乃禾老師的 GEO-seq 技術(shù)在 Nature Protocols 上發(fā)表 [2]。目前已發(fā)表的關(guān)于空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)有主要有 Spatial Transcriptomics, Slide-seq, LCM-seq, seqFISH, MERFISH, Liver single cell zonation, Geo-seq 和 Tomo-seq, 涉及物種有人、小鼠、果蠅、秀麗隱桿線蟲、斑馬魚、擬南芥、楊樹和云杉等。
▲圖 常見空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)
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其中，瑞典皇家理工學(xué)院的 Joakim Lundeberg，基于芯片和空間條形碼技術(shù)發(fā)明了高通量的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法，并創(chuàng)建了 Spatial Transcriptomics 公司。2018 年底 10X Genomics 宣布收購 Spatial Transcriptomics，并于 2019 年發(fā)布 Visium 空間基因表達(dá)解決方案（Visium Spatial Gene Expression Solution）。10X Genomics 公司提供的 Visium 空間基因表達(dá)解決方案是高通量空間轉(zhuǎn)錄組的商業(yè)化解決方案，其可以檢測(cè)完整組織切片的總 mRNA，將總 mRNA 的空間信息與形態(tài)學(xué)內(nèi)容相結(jié)合，并繪制所有基因表達(dá)發(fā)生的位置，獲得完整的基因表達(dá)圖譜；在確定不同細(xì)胞群的同時(shí)保留空間位置，為細(xì)胞功能、表型和組織微環(huán)境中位置的關(guān)系提供了重要信息。
空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)優(yōu)勢(shì)：是轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域的新方向，也是研究細(xì)胞異質(zhì)性方面的新方法。
1、伯豪個(gè)性化方案：空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究需求千差萬別，伯豪生物專業(yè)科研團(tuán)隊(duì)針對(duì)客戶需求一對(duì)一項(xiàng)目建議，為客戶定制空間基因表達(dá)解決方案。
2、組織保存液：空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)對(duì)樣本質(zhì)量要求高，新鮮組織樣本需要立即冷凍包埋才能更好的保持樣本 RNA 質(zhì)量，從而保障實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。伯豪生物自研了伯優(yōu)®組織保存液，4℃條件下新鮮組織樣本離體 48 小時(shí)，細(xì)胞活性及細(xì)胞形態(tài)結(jié)果無明顯影響，有效解決樣本采集→保存運(yùn)輸→冷凍包埋的不良影響。
3、高質(zhì)量組織切片制備：伯豪生物科研服務(wù)團(tuán)隊(duì)經(jīng)大量項(xiàng)目樣本經(jīng)驗(yàn)累積，探索出 對(duì)多種類型組織制備出高質(zhì)量切片方法：“不同組織類型的切片需要優(yōu)化不同的條件”。
4、全面的生信分析流程和個(gè)性化數(shù)據(jù)分析。
將冷凍組織切片放置在空間轉(zhuǎn)錄組芯片的捕獲區(qū)域內(nèi)，進(jìn)行 HE 染色和成像后，對(duì)組織切片進(jìn)行透化處理，細(xì)胞內(nèi)的 mRNA 釋放，從而被芯片上帶有 oligo-dT 的探針捕獲，并且每個(gè)探針都帶有特異的位置信息（Spatial barcode），然后以 mRNA 為模版進(jìn)行 cDNA 合成，構(gòu)建文庫后再通過測(cè)序，獲得基因表達(dá)信息的同時(shí)，每一條測(cè)序 reads 因帶有 Spatial barcode，從而能夠獲得基因表達(dá)的位置信息。
▲圖 空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)的原理
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空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)包含兩種芯片，分別為組織優(yōu)化芯片（Tissue Optimization）和基因表達(dá)芯片（Library Preparation）。組織優(yōu)化芯片用來摸索組織透化的時(shí)間，基因表達(dá)芯片用來進(jìn)行正式樣本的空間轉(zhuǎn)錄組實(shí)驗(yàn)。其中基因表達(dá)芯片上有 4 個(gè)捕獲區(qū)域，每個(gè)區(qū)域大小為 6.5mm×6.5mm，每個(gè)捕獲區(qū)域中有 5000 個(gè)帶有特異地址序列的探針簇，稱為 barcoded spots，每個(gè) spot 直徑為 55um，包含數(shù)百萬個(gè)用于捕獲的 oligo 探針序列，相鄰兩個(gè) spot 的中心距離為 100um。探針序列的結(jié)構(gòu)為：測(cè)序引物結(jié)合序列，16nt 的位置序列，12nt 的 UMI 序列以及 30nt 的 oligo-dT 序列。
▲圖 空間轉(zhuǎn)錄組兩種芯片
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▲圖 空間轉(zhuǎn)錄組基因表達(dá)芯片工作原理
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▲圖 空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)流程
1、異戊烷和液氮�。喝鐖D所示，不銹鋼燒杯內(nèi)倒入異戊烷至 2 / 3 體積，然后將不銹鋼燒杯放入液氮中（與異戊烷液位相同），孵育 15 分鐘。
2、新鮮樣本可用 PBS 沖洗，去除殘留血液，然后使用實(shí)驗(yàn)室紙巾吸干組織表面多余的血液或液體，防止冰晶的形成（注：組織長(zhǎng)和寬不可超過 6mm±0.2mm，否則后續(xù)實(shí)驗(yàn)無法貼片）。
3、用鑷子或刮刀將組織整體浸沒在異戊烷中，直至整體冰凍（注：冷凍時(shí)間可根據(jù)組織類型和大小而改變）。
4、冷凍后，取出組織轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的密封容器中，干冰轉(zhuǎn)移至 -80°長(zhǎng)期保存或立即進(jìn)行下一步（注：為防止組織樣品蒸發(fā)和脫水，冷凍的組織樣品必須儲(chǔ)存在密封容器中以長(zhǎng)期保存）。
方法二：冷凍組織包埋（常用）
1、粉狀干冰：用研缽和杵準(zhǔn)備干冰粉。
2、冷凍 OCT：將 OCT 放在冰上≥30 分鐘（注：OCT 請(qǐng)使用指定品牌）。
3、預(yù)冷鑷子：將鑷子放在干冰中≥30 分鐘。
4、包埋盒上需標(biāo)記組織樣本的方向（注：在添加 OCT 和組織之前，需先在包埋盒上標(biāo)記，因?yàn)橐坏﹥鼋Y(jié)，OCT 將迅速變成白色，這使得以后很難確定組織方向）。
5、用冷卻的 OCT 鋪平包埋盒底部，避免產(chǎn)生氣泡。
6、從不銹鋼燒杯中取出冰凍的組織，加入到 OCT 的包埋盒中心位置，繼續(xù)倒入 OCT 覆蓋樣本。需避免氣泡產(chǎn)生，尤其在組織附近。
7、立即將含有組織和 OCT 的包埋盒放在干冰粉上，直至整體凍結(jié)（約 20min 以上）。
8、將包埋盒放置到密封袋中，干冰運(yùn)輸。
注意事項(xiàng)
1、新鮮組織樣本包埋
目前新鮮組織的包埋方法有兩種，一種是液氮 + 異戊烷法；另一種的干冰法。對(duì)于臨床手術(shù)切下來的組織樣本一般使用干冰的包埋方法。對(duì)于穿刺樣本等一些較小，較輕的樣本，一般推薦用液氮 + 異戊烷的方法進(jìn)行冷凍。OCT 包埋組織塊可以在–80ºC 的密封容器中長(zhǎng)期保存，或立即進(jìn)行冷凍切片。
2、冷凍切片切、組織樣本質(zhì)控及貼片
由于空間轉(zhuǎn)錄組檢測(cè)的是組織中的 RNA，因此要對(duì)切片中的 RNA 質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)。我們一般取 10 片組織切片進(jìn)行 RNA 抽提并質(zhì)檢，確定組織中 RNA 完整性（RIN>7）。所以要求我們的組織樣本要保證可以切到至少 20 片 10um 厚度的切片，以便完成所有的實(shí)驗(yàn)。
3、組織優(yōu)化
組織優(yōu)化的目的是摸索樣本的透化條件，保證組織切片中的 mRNA 能夠充分釋放。該步驟是獲取真實(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的必要條件。否則，我們無法判斷是基因表達(dá)高低到底是因?yàn)橥富怀浞謱?dǎo)致的，還是實(shí)際就是這個(gè)樣子。因此：每個(gè)樣本建議都要做透化，尤其是臨床樣本。
4、成像
應(yīng)使用 Visium Imaging Test Slide 驗(yàn)證成像設(shè)置。明場(chǎng)成像基準(zhǔn)框和基準(zhǔn)標(biāo)記應(yīng)清晰可見，并使用 Brightfeld 設(shè)置聚焦。Visium Imaging Test Slide 四個(gè)區(qū)域（A1，B2，C1，D2）具有熒光斑點(diǎn)，可通過 TRITC 和 Cy5 flter cubes 檢測(cè)到，熒光設(shè)置應(yīng)清晰可見 A1，B2，C1 和 D2 中的熒光點(diǎn)，且熒光點(diǎn)信號(hào)應(yīng)從左到右減小。
5、正式實(shí)驗(yàn)
正式實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)反轉(zhuǎn)錄后的 cDNA 長(zhǎng)度分布，濃度和量進(jìn)行判斷。cDNA 的長(zhǎng)度分布在~200bp-9000bp 之間，在 1000bp 左右會(huì)有峰值（不同的組織類型會(huì)有些許差異）。
6、測(cè)序
在捕獲區(qū)域，每個(gè)組織覆蓋的 spot 建議至少測(cè) 50000 read pairs。整個(gè)捕獲區(qū)域共有 5000 個(gè) spots�？梢愿鶕�(jù)組織貼到芯片上后，覆蓋芯片的大小來判斷測(cè)序的數(shù)據(jù)量。
計(jì)算公式（Coverage Area x total spots on the Capture Area)x 50,000 read pairs/spot 例如：組織覆蓋了 60% 的區(qū)域，則數(shù)據(jù)量為（0.60 x 5,000 total spots) x 50,000 read pairs/spot=150 million read pairs。
圖 切片覆蓋芯片區(qū)域百分比
空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的核心是根據(jù)每個(gè)芯片上每個(gè) spot 的基因表達(dá)信息進(jìn)行聚類，然后將 spot 根據(jù)坐標(biāo)位置序列放回到組織的圖像上，同時(shí)可以對(duì)每個(gè) gene 在組織上表達(dá)的空間位置進(jìn)行定位。
獲得測(cè)序數(shù)據(jù)后，首先利用 Space Ranger 軟件可以自動(dòng)化的對(duì)圖像進(jìn)行處理、數(shù)據(jù)比對(duì)和 Barcode 處理。另外一個(gè)軟件 Loupe Cell Browser 是一個(gè)適用于 Windows 和 MacOS 的桌面應(yīng)用程序，它可以快速、輕松地可視化和分析 10X Visium 數(shù)據(jù)。伯豪生物除了提供 spot 基因數(shù)和 UMI 數(shù)統(tǒng)計(jì)、切片 spot 聚類和聚類亞群 marker 基因分析等基礎(chǔ)和高級(jí)分外，同時(shí)還提供個(gè)性化分析，如特定 pathway 功能富集分析等。
▲圖 每個(gè) spot 特異表達(dá)的基因數(shù)統(tǒng)計(jì)
▲圖 聚類結(jié)果及切片 spot 位置分布展示
▲圖 特定 pathway 功能富集分析
結(jié)合組織區(qū)域分布對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘
大部分組織其實(shí)是有其特定的區(qū)域劃分的，比如說大腦里有皮層、丘腦、海馬、脈絡(luò)叢等多個(gè)區(qū)域。將組織的區(qū)域劃分和亞群（或細(xì)胞類型）的分布結(jié)合起來還是能發(fā)現(xiàn)很多有價(jià)值的信息的。
可以根據(jù)不同區(qū)域特異表達(dá)的 maker 基因的分布來判斷每個(gè)區(qū)域在組織切片上的位置。例如皮層 marker 基因 STX1A 的表達(dá)分布，海馬 marker 基因 HPCA 的表達(dá)分布等。
結(jié)合病理學(xué)特征對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘
空間轉(zhuǎn)錄組技術(shù)正真的精髓不是研究細(xì)胞亞群的分布，而在于將它在空間位置上體現(xiàn)的異質(zhì)性跟組織病理學(xué)特征的分布進(jìn)行結(jié)合，挖掘在不同病理學(xué)特征下轉(zhuǎn)錄組學(xué)的差異。這對(duì)于研究疾病病變的機(jī)制、幫助臨床實(shí)現(xiàn)更好的患者分子分型、以及空間位置 Biomarker 的挖掘方面都是非常有價(jià)值的。通過手動(dòng)把這些區(qū)域圈出來進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組層面的比較，找出不同病灶區(qū)的特異性 marker，分析疾病在一步步發(fā)展進(jìn)程中生物學(xué)功能的變化，甚至可以思考一下是否能找出一些關(guān)鍵性因子來阻斷疾病的進(jìn)展。
▲圖 根據(jù)病理信息選取特定區(qū)域分析
空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合單細(xì)胞 RNA 測(cè)序解析細(xì)胞類型的空間位置信息（Multimodal intersection analysis,MIA)
空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序可以獲得不同基因在組織切片上的空間位置信息，但不能獲得詳細(xì)的細(xì)胞類群信息（空間轉(zhuǎn)錄組不是單細(xì)胞分辨率，只能粗略的分析切片上不同位置的細(xì)胞類型）。因此，需要借助但細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)來分析細(xì)胞類型，然后通過生物信息學(xué)的分析方法將單細(xì)胞類群映射到空間轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)上。
▲圖 MIA 熱圖
備注：MIA 熱圖，上方的顏色條反映了 ST 區(qū)域的子聚類（cancer region，Pancreatic tissue，Duct epithelium 和 stroma）。左側(cè)代表不同的細(xì)胞類群。色塊代表 enrichment 或者 depletion。Enrichment 代表該細(xì)胞類群富集到了該區(qū)域。Depletion 代表該細(xì)胞類群在該區(qū)域缺失。
空間位置信息，或者細(xì)胞在組織中天然的狀態(tài)在研究過程中其實(shí)具有十分重要的價(jià)值，特別針對(duì)某些研究領(lǐng)域，如發(fā)育生物學(xué)（不同位置的細(xì)胞接受不同的信號(hào)濃度梯度、響應(yīng)不同的外界刺激，具有不同的發(fā)育命運(yùn)）、腫瘤生物學(xué)（腫瘤組織與癌旁組織的區(qū)別，腫瘤細(xì)胞侵潤(rùn)過程中腫瘤細(xì)胞的變化與對(duì)正常細(xì)胞的影響，腫瘤轉(zhuǎn)移的不同過程階段等）、腦神經(jīng)科學(xué)（不同腦區(qū)位置的神經(jīng)元結(jié)構(gòu)、神經(jīng)連結(jié)，中間神經(jīng)元投射，突觸前后，神經(jīng)膠質(zhì)相互影響等等），細(xì)胞來源的位置信息是極為關(guān)鍵的決定因素。
空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)除了在人和動(dòng)物上得到了廣泛的應(yīng)用之外，在植物領(lǐng)域也有所突破。2017 年發(fā)表在 nature plant 上的一篇文章就闡釋了空間轉(zhuǎn)錄組在擬南芥中的應(yīng)用，利用空間數(shù)據(jù)作者分析了 141 個(gè)基因的表達(dá)水平差異，8 個(gè)花序組織域中 189 條通路。伯豪生物作為較早的空間轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)服務(wù)商，也在植物的空間轉(zhuǎn)庫組領(lǐng)域有所突破。開發(fā)了多種植物組織的空間轉(zhuǎn)錄組樣本制備，透化條件摸索等。獲得了寶貴的項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)。
常見空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用方向主要在腫瘤學(xué)，免疫學(xué)，發(fā)育生物學(xué)，神經(jīng)科學(xué)及病理學(xué)等方向。
▲圖 空間轉(zhuǎn)錄組的應(yīng)用方向
▲表 已做過優(yōu)化的樣本類型
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