膜片鉗與植物膜生物學(xué)研究

何龍飛1 、2 　沈振國(guó)1 劉友良1 　王愛勤2 (1 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)系,南京210095 　　2 廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院,南寧530004 )
　　
膜片鉗技術(shù)(patch2clamp technique ,PC) 是原西德馬普所Erwin Neher 和Bert Sakmann 于1976 年發(fā)明的,他們首先將此技術(shù)應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞的乙酰膽堿受體通道的研究,由于他們對(duì)這一技術(shù)及其在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用作出了杰出貢獻(xiàn),而榮獲1991 年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。八十年代以來(lái),經(jīng)過(guò)Hamill 等的進(jìn)一步完善,加上原生質(zhì)體、液泡等分離技術(shù)的成熟,膜片鉗技術(shù)在植物細(xì)胞膜生物學(xué)和分子生物學(xué)研究得到廣泛應(yīng)用,并取得了豐碩成果。

1 　膜片鉗技術(shù)原理
膜片鉗技術(shù)是從一小片(約幾平方微米) 膜獲取電子學(xué)方面信息的技術(shù),即保持跨膜電壓恒定— 電壓鉗位,從而測(cè)量通過(guò)膜離子電流大小的技術(shù)。進(jìn)行膜片鉗測(cè)量時(shí),將經(jīng)過(guò)拋光的、尖端直徑為1 -2μm 的玻璃微吸管壓在經(jīng)酶清潔的膜表面,形成高阻封接,電阻可達(dá)10 -100 GΩ。由于電性能完全絕緣,微吸管阻抗相對(duì)較低,背景噪音降低,在微吸管內(nèi)充灌適當(dāng)鹽溶液,同時(shí)施加電壓,對(duì)膜片進(jìn)行電壓鉗位,此時(shí),通過(guò)膜片離子通道的電流便流入微吸管,再由銀電極將該電流引入測(cè)量電路,再經(jīng)過(guò)放大處理,便得到離子通道的離子流,從而能了解通過(guò)膜離子通道的離子運(yùn)輸、信號(hào)傳遞等信息。
由于玻璃微電極與細(xì)胞膜之間的高阻封接非常穩(wěn)定和牢固,所以膜片鉗可以采用多種測(cè)量方式(圖1)


圖1 　膜片鉗的幾種測(cè)量方式
Cell2acttached :細(xì)胞粘附式
whole2cell :全細(xì)胞式　　
slow whole2cell :慢全細(xì)胞式
outside2out :外翻外式　　
inside2out :內(nèi)翻外式

玻璃微吸管只是壓在膜表面的測(cè)量方式稱為細(xì)胞粘附式,在細(xì)胞粘附式基礎(chǔ)上,如在微吸管內(nèi)作短暫的脈動(dòng)抽吸,吸破膜片,使微吸管與胞內(nèi)導(dǎo)電,就形成全細(xì)胞式,全細(xì)胞式能對(duì)常規(guī)微電極不能研究的許多小細(xì)胞進(jìn)行研究。全細(xì)胞式又有慢全細(xì)胞式和快全細(xì)胞式之分,前者主要用于研究藥物對(duì)通道蛋白的影響,后者則用于研究細(xì)胞分泌。在全細(xì)胞式基礎(chǔ)上,抽起微吸管,在空氣中稍作停留,則可得到“內(nèi)面向外和“外面向外的膜片,也稱“切割膜片”,這些小膜片在化學(xué)性質(zhì)上被完全隔離,允許任意改變膜內(nèi)、外離子環(huán)境, 觀察其對(duì)膜通道的影響,這種記錄模式分別稱為“內(nèi)翻外式和“外翻外式。此外,還有“開放細(xì)胞吸附膜內(nèi)翻外式(open cell2attched inside2out mode) ”和“穿孔囊泡膜外翻外(perforated vesicle outside2out mode) ”等模式。

膜片鉗記錄到的是通道電流。圖2 記錄到的是懸浮培養(yǎng)Chenopodi u m rubru m 細(xì)胞液泡SV 型通道的單通道電流。單通道電流由矩形脈沖構(gòu)成,是持續(xù)無(wú)規(guī)則的,反映出小分子構(gòu)象變化。向上電流表示通道開放,向下表示通道關(guān)閉,其持續(xù)時(shí)間即通道開放和關(guān)閉時(shí)間。電流變化幅度表示離子在給定時(shí)間內(nèi)通過(guò)通道的數(shù)目。通道開放和關(guān)閉的持續(xù)時(shí)間依賴于所施加電壓和各種影響通道蛋白的因素(如Ca2 + 1p H1 第二信使、磷酸化作用) 。對(duì)開放和關(guān)閉時(shí)間間隔及電流大小等進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,可得到通道蛋白的分子動(dòng)力學(xué)特點(diǎn),如確定通道類型,開放通道平均數(shù)離子流量等。目前,膜片鉗技術(shù)的電流測(cè)量靈敏度已達(dá)P 安培(PA) 級(jí),空間分辨率達(dá)1μm ,時(shí)間分辨率達(dá)10HS。

圖2 　Chenopodium rubrum 液泡膜SV 型通道的單通道電流記錄

2 　膜片鉗技術(shù)在植物膜生物學(xué)研究中應(yīng)用
自從利用膜片鉗技術(shù)在植物細(xì)胞中證實(shí)離子通道的存在以來(lái),膜片鉗技術(shù)以其特有的優(yōu)勢(shì)而被廣泛應(yīng)用于植物膜生物學(xué)的研究。

物質(zhì)運(yùn)輸
早已了解到生物膜上主要有三種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白:離子泵、通道和載體,但對(duì)它們?cè)诳刂齐x子和代謝物質(zhì)運(yùn)輸中的作用和分工一直了解不多,因?yàn)閷?duì)它們的活動(dòng)難以進(jìn)行區(qū)別,尤其是載體協(xié)助擴(kuò)散運(yùn)輸方式和離子通道都是沿濃度梯度或電位梯度進(jìn)行的順勢(shì)流動(dòng),區(qū)別起來(lái)更為困難。利用膜片鉗技術(shù)已經(jīng)能分辯出離子通道和載體間的差異:載體蛋白最大周轉(zhuǎn)率為104 -105 次/ 秒,即每秒鐘運(yùn)輸104 -105 個(gè)離子;離子通道每秒可傳遞多于106 個(gè)離子,一個(gè)典型離子通道每秒可通過(guò)107 個(gè)離子,二者運(yùn)輸速率相差100 -1000 倍[ 3 ] 。因此,應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以區(qū)別物質(zhì)通過(guò)膜的運(yùn)輸方式。利用膜片鉗技術(shù),已證實(shí)在植物細(xì)胞中存在許多種類離子通道,如K+ 通道、Ca2 + 通道、Cl -通道、NO3 -通道、有機(jī)酸離子通道(如蘋果酸) 等,并了解了其生理特性,加深了對(duì)植物進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收和運(yùn)輸?shù)恼J(rèn)識(shí)。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo),尤其是逆境信息的感受和傳遞一直備受關(guān)注,但對(duì)其分子機(jī)制一直了解不多。近年來(lái), 利用膜片鉗技術(shù)結(jié)合其它手段,大大加深了對(duì)這一問(wèn)題的認(rèn)識(shí)。逆境(如干旱、鹽) 脅迫下,通常引起植物葉片氣孔關(guān)閉,用膜片鉗和其它手段,已較清楚地了解這一過(guò)程的作用模式:逆境條件下,根尖合成ABA , 通過(guò)導(dǎo)管向地上運(yùn)輸,到達(dá)葉片細(xì)胞質(zhì)外體,ABA 激活保衛(wèi)細(xì)胞質(zhì)膜上的非特異陽(yáng)離子通道,Ca2 + 內(nèi)流,使胞質(zhì)Ca2 + 濃度增加,到達(dá)一定水平后,激活K+ 外流通道,引起K+ 迅速大量外流,蘋果酸含量下降,保衛(wèi)細(xì)胞膨壓?jiǎn)适?氣孔關(guān)閉。
應(yīng)用膜片鉗研究植物對(duì)病蟲害侵襲的防御反應(yīng)也取得較大成功。用水稻特異激發(fā)子處理煙草時(shí),真菌激發(fā)子誘導(dǎo)激活煙草細(xì)胞質(zhì)膜上的Ca2 + 通道,提高通道開放機(jī)率,Ca2 + 內(nèi)流增加,導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2 + 濃度上升, 激活植物防御反應(yīng)系統(tǒng), 阻止細(xì)胞死亡, 接著, 胞質(zhì)Ca2 + 繼續(xù)激活蛋白激酶,引起級(jí)聯(lián)反應(yīng),使質(zhì)膜H+ ¬A TPase 再磷酸化,從而恢復(fù)正常細(xì)胞功能 。

細(xì)胞分泌
由于膜片鉗技術(shù)靈敏度高,用其并結(jié)合細(xì)胞生理學(xué)與分子生理學(xué)等技術(shù)來(lái)研究細(xì)胞分泌機(jī)制是非常新穎有效的手段。其原理在于細(xì)胞分泌的胞吐過(guò)程是在細(xì)胞膜上進(jìn)行的,它會(huì)引起細(xì)胞形態(tài)的改變和物質(zhì)流動(dòng),從而導(dǎo)致膜片參數(shù)發(fā)生變化,尤其是伴隨著分泌活性,整個(gè)細(xì)胞表面積(與膜電容成正比) 必然增加,通過(guò)測(cè)量細(xì)胞膜電容,便可估計(jì)單細(xì)胞的分泌活性[ 5 ] 。在動(dòng)物細(xì)胞中,通過(guò)膜片鉗實(shí)驗(yàn),已初步得到了肥大細(xì)胞分泌調(diào)控模型、嗜鉻細(xì)胞分泌調(diào)控模型,而植物細(xì)胞則較少有報(bào)道,可能與植物細(xì)胞分泌時(shí)引起表面積變化相對(duì)較小,不易清楚區(qū)分有關(guān),相信不久會(huì)有所突破。

分子生物學(xué)研究
膜片鉗技術(shù)也是研究轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因克隆、表達(dá)和功能分析的有效手段。將轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的cRNA 注射入卵母細(xì)胞,在卵母細(xì)胞內(nèi)便合成轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,并以功能狀態(tài)整合到細(xì)胞膜上,再應(yīng)用膜片鉗分析,便可證實(shí)該基因結(jié)構(gòu)與功能間的一致性。如利用注入不同量KA T1 的cRNA 以控制KA T1 在卵母細(xì)胞中的表達(dá), 膜片鉗記錄到K+ 內(nèi)流量隨入cRNA 量增加而上升, 再加入外源的K+ 內(nèi)流通道阻塞劑,發(fā)現(xiàn)其抑制常數(shù)隨注入的cRNA 量由015ng 增加到28ng 而增加了7 倍,說(shuō)明KA T1 屬于K+ 內(nèi)流通道[ 6 ] ,在此基礎(chǔ)上還可對(duì)其功能作進(jìn)一步分析。用這一方法,對(duì)氨基酸、蔗糖、N H4 + 、脯氨酸等的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行了深入的分析。

此外,膜片鉗技術(shù)還可用于轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的遺傳特性、突變體和轉(zhuǎn)導(dǎo)植株分析 ,以及轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白分子運(yùn)動(dòng)、物質(zhì)運(yùn)輸?shù)膭?dòng)力學(xué)性質(zhì)的研究。