膜片鉗記錄和分析技術(shù)介紹

瀏覽次數(shù)：11340　發(fā)布日期：2009-12-11　來源：本站　僅供參考，謝絕轉(zhuǎn)載，否則責(zé)任自負(fù)

膜片鉗技術(shù)原理及應(yīng)用

      細(xì)胞是動(dòng)物和人體的基本組成單元，細(xì)胞與細(xì)胞內(nèi)的通信,是依靠其膜上的離子通道進(jìn)行的，離子和離子通道是細(xì)胞興奮的基礎(chǔ)，亦即產(chǎn)生生物電信號(hào)的基礎(chǔ)，生物電信號(hào)通常用電學(xué)或電子學(xué)方法進(jìn)行測量。由此形成了一門細(xì)胞學(xué)科—電生理學(xué)（electrophysiology），即是用電生理的方法來記錄和分析細(xì)胞產(chǎn)生電的大小和規(guī)律的科學(xué)。
早期的研究多使用雙電極電壓鉗技術(shù)作細(xì)胞內(nèi)電活動(dòng)的記錄�，F(xiàn)代膜片鉗技術(shù)是在電壓鉗技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。
     1976年德國馬普生物物理研究所Neher和Sakmann創(chuàng)建了膜片鉗技術(shù)（patch clamp recording technique）。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細(xì)胞膜單一的（或多個(gè)的離子通道分子活動(dòng)的技術(shù)）。以后由于吉?dú)W姆阻抗封接(gigaohm seal, 109Ω)方法的確立和幾種方法的創(chuàng)建。這種技術(shù)點(diǎn)燃了細(xì)胞和分子水平的生理學(xué)研究的革命之火，它和基因克隆技術(shù)（gene cloning）并架齊驅(qū)，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進(jìn)動(dòng)力。
     這一偉大的貢獻(xiàn)，使Neher和Sakmann獲得1991年度的諾貝爾生理學(xué)與醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。

一、膜片鉗技術(shù)發(fā)展歷史
        1976年德國馬普生物物理化學(xué)研究所Neher和Sakmann首次在青蛙肌細(xì)胞上用雙電極鉗制膜電位的同時(shí)，記錄到ACh激活的單通道離子電流，從而產(chǎn)生了膜片鉗技術(shù)。
         1980年Sigworth等在記錄電極內(nèi)施加5-50 cmH2O的負(fù)壓吸引，得到10-100GΩ的高阻封接（Giga-seal），大大降低了記錄時(shí)的噪聲實(shí)現(xiàn)了單根電極既鉗制膜片電位又記錄單通道電流的突破。
        1981年Hamill和Neher等對(duì)該技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn)，引進(jìn)了膜片游離技術(shù)和全細(xì)胞記錄技術(shù)，從而使該技術(shù)更趨完善，具有1pA的電流靈敏度、1μm的空間分辨率和10μs的時(shí)間分辨率。
        1983年10月，《Single-Channel Recording》一書問世，奠定了膜片鉗技術(shù)的里程碑。Sakmann 和Neher也因其杰出的工作和突出貢獻(xiàn)，榮獲1991年諾貝爾醫(yī)學(xué)和生理學(xué)獎(jiǎng)。

二：膜片鉗技術(shù)原理
膜片鉗技術(shù)是用玻璃微電極吸管把只含1-3個(gè)離子通道、面積為幾個(gè)平方微米的細(xì)胞膜通過負(fù)壓吸引封接起來（見右圖），由于電極尖端與細(xì)胞膜的高阻封接，在電極尖端籠罩下的那片膜事實(shí)上與膜的其他部分從電學(xué)上隔離，因此，此片膜內(nèi)開放所產(chǎn)生的電流流進(jìn)玻璃吸管，用一個(gè)極為敏感的電流監(jiān)視器（膜片鉗放大器）測量此電流強(qiáng)度，就代表單一離子通道電流。

膜片鉗技術(shù)的建立，對(duì)生物學(xué)科學(xué)特別是神經(jīng)科學(xué)是一資有重大意義的變革。這是一種以記錄通過離子通道的離子電流來反映細(xì)胞膜單一的（或多個(gè)的離子通道分子活動(dòng)的技術(shù)。些技術(shù)的出現(xiàn)自然將細(xì)胞水平和分子水平的生理學(xué)研究聯(lián)系在一起，同時(shí)又將神經(jīng)科學(xué)的不同分野必然地融匯在一起，改變了既往各個(gè)分野互不聯(lián)系、互不滲透，阻礙人們?nèi)嬲J(rèn)識(shí)能力的弊端。
這一技術(shù)的發(fā)現(xiàn)和基因克隆技術(shù)并架齊驅(qū)，給生命科學(xué)研究帶來了巨大的前進(jìn)動(dòng)力。

三：全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)
膜片鉗技術(shù)被稱為研究離子通道的“金標(biāo)準(zhǔn)”。是研究離子通道的最重要的技術(shù)。目前膜片鉗技術(shù)已從常規(guī)膜片鉗技術(shù)（Conventional patch clamp technique）發(fā)展到全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)（Automated patch clamp technique）。
傳統(tǒng)膜片鉗技術(shù)每次只能記錄一個(gè)細(xì)胞（或一對(duì)細(xì)胞），對(duì)實(shí)驗(yàn)人員來說是一項(xiàng)耗時(shí)耗力的工作，它不適合在藥物開發(fā)初期和中期進(jìn)行大量化合物的篩選，也不適合需要記錄大量細(xì)胞的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究。全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)的出現(xiàn)在很大程度上解決了這些問題，它不僅通量高，一次能記錄幾個(gè)甚至幾十個(gè)細(xì)胞，而且從找細(xì)胞、形成封接、破膜等整個(gè)實(shí)驗(yàn)操作實(shí)現(xiàn)了自動(dòng)化，免除了這些操作的復(fù)雜與困難。這兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)使得膜片鉗技術(shù)的工作效率大大提高了！簽于全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)的這些優(yōu)點(diǎn)，目前已經(jīng)廣泛的用于藥物篩選。

四：膜片鉗技術(shù)的應(yīng)用
1. 應(yīng)用學(xué)科
         膜片鉗技術(shù)發(fā)展至今，已經(jīng)成為現(xiàn)代細(xì)胞電生理的常規(guī)方法，它不僅可以作為基礎(chǔ)生物醫(yī)學(xué)研究的工具，而且直接或間接為臨床醫(yī)學(xué)研究服務(wù)，
        目前膜片鉗技術(shù)廣泛應(yīng)用于神經(jīng)（腦）科學(xué)、心血管科學(xué)、藥理學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、病理生理學(xué)、中醫(yī)藥學(xué)、植物細(xì)胞生理學(xué)、運(yùn)動(dòng)生理等多學(xué)科領(lǐng)域研究。
         隨著全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)（Automatic patch clamp technology）的出現(xiàn)，膜片鉗技術(shù)因其具有的自動(dòng)化、高通量特性，在藥物研發(fā)、藥物篩選中顯示了強(qiáng)勁的生命力。
2. 應(yīng)用的標(biāo)本種類
         使用的標(biāo)本種類繁多。從最早的肌細(xì)胞（心肌、平滑肌、骨骼�。⑸窠�(jīng)元和內(nèi)分泌細(xì)胞發(fā)展到血細(xì)胞、肝細(xì)胞、耳窩毛細(xì)胞、胃壁細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞、精母細(xì)胞等多種細(xì)胞；從急性分散細(xì)胞和培養(yǎng)細(xì)胞（包括細(xì)胞株）發(fā)展到組織片（如腦片、脊髓片）乃至整體動(dòng)物；從蝸牛、青蛙、蠑螈、爪蟾卵母細(xì)胞發(fā)展到雞細(xì)胞、大鼠細(xì)胞、人細(xì)胞等等；從動(dòng)物細(xì)胞發(fā)展到細(xì)菌、真菌以及植物細(xì)胞。此外，膜片鉗技術(shù)還廣泛地應(yīng)用到平面雙分子層（Planar bilayer）、脂質(zhì)體（Liposome）等人工標(biāo)本上。
3. 研究對(duì)象
         研究對(duì)象已經(jīng)不局限于離子通道。從對(duì)離子通道（配體門控性、電壓門控性、第二信使介導(dǎo)的離子通道、機(jī)械敏感性離子通道以及縫隙連接通道等等）的研究發(fā)展到對(duì)離子泵、交換體以及可興奮細(xì)胞的胞吞、胞吐機(jī)制的研究等。
4. 應(yīng)用舉例：
(1). 膜片鉗技術(shù)在通道研究中的重要作用
        應(yīng)用膜片鉗技術(shù)可以直接觀察和分辨單離子通道電流及其開閉時(shí)程、區(qū)分離子通道的離子選擇性、同時(shí)可發(fā)現(xiàn)新的離子通道及亞型，并能在記錄單細(xì)胞電流和全細(xì)胞電流的基礎(chǔ)上進(jìn)一步計(jì)算出細(xì)胞膜上的通道數(shù)和開放概率，還可以用以研究某些胞內(nèi)或胞外物質(zhì)對(duì)離子通道開閉及通道電流的影響等。同時(shí)用于研究細(xì)胞信號(hào)的跨膜轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞分泌機(jī)制。結(jié)合分子克隆和定點(diǎn)突變技術(shù)，膜片鉗技術(shù)可用于離子通道分子結(jié)構(gòu)與生物學(xué)功能關(guān)系的研究。
         利用膜片鉗技術(shù)還可以用于藥物在其靶受體上作用位點(diǎn)的分析。如神經(jīng)元煙堿受體為配體門控性離子通道，膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)通過記錄煙堿誘發(fā)電流，可直觀地反映出神經(jīng)元煙堿受體活動(dòng)的全過程，包括受體與其激動(dòng)劑和拮抗劑的親和力，離子通道開放、關(guān)閉的動(dòng)力學(xué)特征及受體的失敏等活動(dòng)。使用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)觀察拮抗劑對(duì)煙堿受體激動(dòng)劑量效曲線的影響，來確定其作用的動(dòng)力學(xué)特征。然后根據(jù)分析拮抗劑對(duì)受體失敏的影響，拮抗劑的作用是否有電壓依賴性、使用依賴性等特點(diǎn)，可從功能上區(qū)分拮抗劑在煙堿受體上的不同作用位點(diǎn)，即判斷拮抗劑是作用在受體的激動(dòng)劑識(shí)別位點(diǎn)，離子通道抑或是其它的變構(gòu)位點(diǎn)上。
(2).與藥物作用有關(guān)的心肌離子通道
       心肌細(xì)胞通過各種離子通道對(duì)膜電位和動(dòng)作電位穩(wěn)態(tài)的維持而保持正常的功能。近年來，國外學(xué)者在人類心肌細(xì)胞離子通道特性的研究中取得了許多進(jìn)展，使得心肌藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)由動(dòng)物細(xì)胞模型向人心肌細(xì)胞成為可能。
(3).對(duì)離子通道生理與病理情況下作用機(jī)制的研究
        通過對(duì)各種生理或病理情況下細(xì)胞膜某種離子通道特性的研究，了解該離子的生理意義及其在疾病過程中的作用機(jī)制。如對(duì)鈣離子在腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損害中作用機(jī)制的研究表明，缺血性腦損害過程中，Ca2+ 介導(dǎo)現(xiàn)象起非常重要的作用，缺血缺氧使Ca2+通道開放，過多的Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)就出現(xiàn)Ca2+超載，導(dǎo)致神經(jīng)元及細(xì)胞膜損害，膜轉(zhuǎn)運(yùn)功能障礙，嚴(yán)重的可使神經(jīng)元壞死
(4).對(duì)單細(xì)胞形態(tài)與功能關(guān)系的研究
        將膜片鉗技術(shù)與單細(xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)欠磻?yīng)技術(shù)結(jié)合，在全細(xì)胞膜片鉗記錄下，將單細(xì)胞內(nèi)容物或整個(gè)細(xì)胞（包括細(xì)胞膜）吸入電極中，將細(xì)胞內(nèi)存在的各種mRNA全部快速逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再經(jīng)常規(guī)PCR擴(kuò)增及待檢的特異mRNA的檢測，借此可對(duì)形態(tài)相似而電活動(dòng)不同的結(jié)果做出分子水平的解釋或?yàn)閱渭?xì)胞逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)提供標(biāo)本，為同一結(jié)構(gòu)中形態(tài)非常相似但功能不同的事實(shí)提供分子水平的解釋。目前國際上掌握此技術(shù)的實(shí)驗(yàn)室較少，我國北京大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所于1994年在國內(nèi)率先開展。
(5).對(duì)藥物作用機(jī)制的研究
        在通道電流記錄中，可分別于不同時(shí)間、不同部位（膜內(nèi)或膜外）施加各種濃度的藥物，研究它們對(duì)通道功能的可能影響，了解那些選擇性作用于通道的藥物影響人和動(dòng)物生理功能的分子機(jī)理。這是目前膜片鉗技術(shù)應(yīng)用最廣泛的領(lǐng)域，既有對(duì)西藥藥物機(jī)制的探討，也廣泛用在重要藥理的研究上。如開麗等報(bào)道細(xì)胞貼附式膜片鉗單通道記錄法觀測到人參二醇組皂苷可抑制正常和“缺血”誘導(dǎo)的大鼠大腦皮層神經(jīng)元L-型鈣通道的開放，從而減少鈣內(nèi)流，對(duì)缺血細(xì)胞可能有保護(hù)作用。陳龍等報(bào)道采用細(xì)胞貼附式單通道記錄法發(fā)現(xiàn)烏頭堿對(duì)培養(yǎng)的Wistar大鼠心室肌細(xì)胞L-型鈣通道有阻滯作用。
(6). 在心血管藥理研究中的應(yīng)用
       隨著膜片鉗技術(shù)在心血管方面的廣泛應(yīng)用，對(duì)血管疾病和藥物作用的認(rèn)識(shí)不僅得到了不斷更新，而且在其病因?qū)W與藥理學(xué)方面還形成了許多新的觀點(diǎn)。正如諾貝爾基金會(huì)在頒獎(jiǎng)時(shí)所說：“Neher和Sadmann的貢獻(xiàn)有利于了解不同疾病機(jī)理，為研制新的更為特效的藥物開辟了道路”。
(7). 創(chuàng)新藥物研究與高通量篩選
        目前在離子通道高通量篩選中主要是進(jìn)行樣品量大、篩選速度占優(yōu)勢、信息量要求不太高的初級(jí)篩選。最近幾年，分別形成了以膜片鉗和熒光探針為基礎(chǔ)的兩大主流技術(shù)市場。將電生理研究信息量大、靈敏度高等特點(diǎn)與自動(dòng)化、微量化技術(shù)相結(jié)合，產(chǎn)生了自動(dòng)化膜片鉗等一些新技術(shù)。

五：廠家介紹
         膜片鉗技術(shù)的核心部分是膜片鉗放大器系統(tǒng)，包括：膜片鉗放大器（Amplifier）、數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器（Digitizer）和數(shù)據(jù)采樣和分析軟件（Software）三個(gè)部分，共同完成離子通道電流的采集、處理和分析。由于離子通道電流的大小通常是在pA到nA范圍內(nèi)，要記錄如此微弱的通道電流信號(hào)，就需要特殊電路設(shè)計(jì)的膜片鉗放大器和高精度、低噪聲的數(shù)模/模數(shù)轉(zhuǎn)換器。
        在膜片放大器系統(tǒng)領(lǐng)域，美國MDC公司生產(chǎn)的AXON系列膜片鉗放大器系統(tǒng)占有主導(dǎo)地位，無論從產(chǎn)品的技術(shù)含量還是從產(chǎn)品的應(yīng)用領(lǐng)域上來看，在膜片鉗技術(shù)中始終處于領(lǐng)先的地位，代表著膜片鉗技術(shù)發(fā)展的方向，是國內(nèi)外膜片鉗實(shí)驗(yàn)室首選實(shí)驗(yàn)儀器，這可以從下面幾個(gè)方面得到體現(xiàn)：
1. 專業(yè)的生產(chǎn)廠家
        AXON是最早生產(chǎn)膜片鉗放大器的廠家，從早期的1D到200A，200B，700A，700B等傳統(tǒng)膜片鉗放大器，到今天的全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)的開發(fā)和應(yīng)用，始終引領(lǐng)著膜片鉗技術(shù)的發(fā)展方向。其pClamp10記錄分析軟件是一款功能全面強(qiáng)大的軟件，可以滿足膜片鉗和電生理所有的需要。系列的膜片鉗放大器系統(tǒng)被認(rèn)為是膜片鉗技術(shù)應(yīng)用的標(biāo)準(zhǔn)系統(tǒng)。
2. 產(chǎn)品種類齊全
        AXON系列膜片鉗放大器系統(tǒng)不僅能夠滿足傳統(tǒng)的膜片鉗研究中所有需要，在全自動(dòng)膜片鉗技術(shù)上更是處于世界領(lǐng)先地位，在高通量藥物篩選中得到廣泛的應(yīng)用。作為一家專業(yè)生產(chǎn)電生理膜片鉗儀器的著名廠家，其產(chǎn)品覆蓋了膜片鉗技術(shù)上所需的所有放大器種類，產(chǎn)品豐富，種類齊全。
3.  應(yīng)用廣泛
         AXON既有應(yīng)用于傳統(tǒng)的膜片鉗技術(shù)的放大器系統(tǒng)，也有應(yīng)用于高通量藥物篩選的全自動(dòng)膜片鉗系統(tǒng)，應(yīng)用面廣。

4. 客戶最多
無論是在國內(nèi)還是在國外，超過80%的用戶使用AXON系列產(chǎn)品。Axon系列產(chǎn)品是被膜片鉗實(shí)驗(yàn)室選用最多的產(chǎn)品。
5. 完善的售后服務(wù)體系
AXON在上海設(shè)有辦事處，提供強(qiáng)大的技術(shù)支持和售后服務(wù)。專業(yè)的代理公司為客戶提供專業(yè)的售前售后服務(wù)。

來源：馬普科學(xué)儀器有限公司
聯(lián)系電話：020-87679617，87679631
E-mail：dido-deng@mapusci.com

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