活細(xì)胞成像技術(shù)--活細(xì)胞工作站介紹

我們知道以往的固定組織揭示了非常多的自然秘密，給了我們很大的啟示，現(xiàn)在的科學(xué)研究則向在最真實(shí)的條件下觀察自然發(fā)展�？v觀顯微鏡的歷史，直到15年前，科學(xué)家主要還是處理死細(xì)胞�，F(xiàn)在，活細(xì)胞的應(yīng)用已經(jīng)非常普及了。

加拿大McGill大學(xué)成像實(shí)驗(yàn)室主任Claire M.Brown表示，要達(dá)到這個(gè)研究目的，我們非常需要一個(gè)不損壞細(xì)胞的封閉環(huán)境、且具有比較理想的成像條件。這一條件尤其對于進(jìn)行動態(tài)、三維成像的多標(biāo)記樣品來說尤其重要。讓人高興的是，近年來在光學(xué)設(shè)計(jì)、多靈敏檢測器、優(yōu)選探針和先進(jìn)軟件方面的改善，使得這一切成為可能。今天的活細(xì)胞工作站，不僅僅限于觀察，目前的趨勢已經(jīng)從結(jié)構(gòu)或細(xì)胞器的分析，轉(zhuǎn)向了功能的相互影響觀察研究。

現(xiàn)在，科學(xué)家可以便利的購買到活組織應(yīng)用的整合新設(shè)備，而不用將系統(tǒng)簡單的拼湊在一起。如，Zeiss、Olympus和Nikon公司都提供適用于活細(xì)胞的倒置研究型顯微鏡。這些設(shè)備可以手動，也可以完全自動化。其他公司也將活細(xì)胞成像與高分辨率有機(jī)的結(jié)合在一起。Leica公司市場部經(jīng)理表示：“Leica TCSSP5寬帶激光共聚焦顯微鏡將活細(xì)胞功能成像與單一的結(jié)構(gòu)共聚焦系統(tǒng)中的最高分辨率結(jié)構(gòu)成像結(jié)合在一起，實(shí)現(xiàn)了兩者的實(shí)時(shí)結(jié)合�！盠eica的全內(nèi)發(fā)射熒光顯微鏡（AMTIRF）對分子和膜運(yùn)輸之間的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)、相互作用成像尤其有用。在照明波動中，這種設(shè)備也能控制照明的深度以及傳播方向。Nelson認(rèn)為，計(jì)算機(jī)對這些變量的完全控制，確保了精確的、可重復(fù)的成像效果。

Nikon的TE2000倒置顯微鏡系列，也為活細(xì)胞成像提供了便利。共聚焦和外熒光成像技術(shù)相結(jié)合，同時(shí)為觀察樣品提供幫助。此外，串聯(lián)顯微鏡包括降噪器，這種特殊的裝置可以吸收掉光路上的雜光，將信噪比（S/N）提升五倍以上，使熒光影像觀察、擷取更為清晰。微速攝影成像正逐漸變得重要起來。Olympus和其他幾家公司提供了零點(diǎn)漂移聚焦補(bǔ)償系統(tǒng)設(shè)備，確保了超時(shí)獲得的成像效果仍然色彩鮮明。

改善細(xì)胞環(huán)境

當(dāng)成像時(shí)間增加時(shí)，細(xì)胞需要更好的環(huán)境調(diào)控。Okolab公司為顯微鏡下的細(xì)胞提供的是與傳統(tǒng)培養(yǎng)箱一樣的環(huán)境。為了評估顯微鏡培育器的性能，Okolab公司將新設(shè)備與常規(guī)的CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行了比較，測試結(jié)果表明，Okolab顯微鏡之下的細(xì)胞環(huán)境與常規(guī)培養(yǎng)箱中的濕度、CO2、溫度條件相同。

在實(shí)驗(yàn)中，必須保證細(xì)胞在照明的條件下也能存活。幸運(yùn)的是，新探針只需要較少的光就可以被激發(fā)，并且改良的照相機(jī)只需要很少量的熒光。成像應(yīng)用專家菲利說道：“需要的光少，曝光時(shí)間就更短�！碑a(chǎn)生的光毒性和光漂白作用就輕，細(xì)胞沒有受到損壞，就能進(jìn)行更長時(shí)間的成像實(shí)驗(yàn)。成像技術(shù)在瞬時(shí)清晰度性能方面的改善，讓研究人員獲得了更多的信息。

說起近幾年最讓人激動的進(jìn)展，應(yīng)該是“有更多更好的生物學(xué)標(biāo)記”，尤其是熒光染料，讓科學(xué)家標(biāo)記更準(zhǔn)確。改善的探針，靈敏的共聚焦系統(tǒng)，能以非常高的速度獲得多維信息�！疤结樃牧疾糠謥碜杂诩ぐl(fā)波長的擴(kuò)展。例如，較長的波長在低能量的情況下就可以激發(fā)，而這樣做對活細(xì)胞來說要溫和得多。Olympus的顯微鏡是為近紅外光設(shè)計(jì)的。因此，可以在樣品內(nèi)部更深的地方成像。用戶也可以從綠色光轉(zhuǎn)換到近紅外光，而不需要調(diào)整顯微鏡的焦距。通過改善鏡片標(biāo)準(zhǔn)和涂層技術(shù)，Olympus的顯微鏡在一個(gè)更廣范圍的波長上具有優(yōu)秀的顏色校正性能。

快速的激發(fā)變化改善了實(shí)驗(yàn)的精確性。采用共區(qū)域化研究，并且對細(xì)胞的不同部分進(jìn)行染色，就可以獲得一個(gè)五彩繽紛的成像效果。激發(fā)波長之間的快速轉(zhuǎn)換可以讓不同的探針在相同的瞬間進(jìn)行成像。

雖然各方面的進(jìn)展不少，但活細(xì)胞成像仍然受到數(shù)據(jù)處理這一老生常談問題的困擾。正如Brown所說，活細(xì)胞成像通常忽略數(shù)據(jù)的處理，認(rèn)為成像處理和分析過程是最費(fèi)時(shí)的方面，這一過程需要受過高度訓(xùn)練的專家。其實(shí)，活細(xì)胞成像另一個(gè)問題是數(shù)據(jù)處理，很容易產(chǎn)生30~60G的文件。因此，許多公司也考慮解決軟件的問題。PerkinElmer公司的PaulOrange表示：“我們已經(jīng)獲得了所有這些高性能的成像設(shè)備，但是人們也需要一個(gè)用戶友好型的軟件進(jìn)行工作，以提供強(qiáng)大的功能�！�

Okolab公司的OKO-Vision也是可以進(jìn)行活細(xì)胞應(yīng)用的顯微鏡。Luca介紹道：“我們的軟件分成幾個(gè)模塊，這樣用戶就可以選擇自己所需要的那部分，包括基礎(chǔ)的二微微速攝影，多通道或自動樣本掃描操作。我們的目標(biāo)是讓用戶不需要程序設(shè)計(jì)，軟件就能執(zhí)行準(zhǔn)確對焦操作。”

目前，活細(xì)胞成像方面的進(jìn)展仍然在不斷涌現(xiàn)�？焖俚�、不斷改善的動態(tài)分析方法，將對活細(xì)胞內(nèi)部的功能蛋白質(zhì)進(jìn)行更好的研究。成像專家也在進(jìn)一步推動原位成像的真實(shí)性。人們不僅想去觀察一個(gè)動物體中的一個(gè)細(xì)胞，并且用顯微鏡進(jìn)行成像，而且也期望看到全貌。你將會看到越來越多的整體動物的成像。對活細(xì)胞成像來說，能同時(shí)進(jìn)行成像，并且區(qū)別多重?zé)晒庑盘枌⒆兊迷絹碓街匾�。最終，這個(gè)領(lǐng)域?qū)⑦M(jìn)化到活動物成像。當(dāng)然，要想實(shí)現(xiàn)這一過程，從器官、系統(tǒng)水平到分子水平的生命過程的觀察，將需要光學(xué)、檢測器、探針和軟件等各方面的不斷進(jìn)步。