Roche利用SPR及單分子質(zhì)量光度系統(tǒng)解碼復(fù)雜抗體結(jié)合模式

TRIM21是一種已知的胞質(zhì)Fc受體，在抗體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)免疫中起著重要作用。之前的研究表明TRIM21與抗體的Fc區(qū)域結(jié)合，能夠中和已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞的病毒，并通過(guò)泛素-蛋白酶體系統(tǒng)將其靶向降解，但是具體的工作機(jī)制還不是非常清楚。

Roche研發(fā)人員最近的工作發(fā)現(xiàn)了TRIM21識(shí)別、結(jié)合并促進(jìn)抗體包被病毒的蛋白酶體降解的能力，在很大程度上依賴(lài)于其與抗體Fc區(qū)域相互作用的親和力(Affinity)和功能親合力(Aidity)。 經(jīng)過(guò)一些列測(cè)試后研究人員提出了一種新的結(jié)合機(jī)制，TRIM21與一個(gè)Fc位點(diǎn)的結(jié)合導(dǎo)致PRYSPRY從螺旋卷曲域上脫落，由于其柔性連接鏈增加了流動(dòng)性，從而促進(jìn)了Fc第二個(gè)位點(diǎn)的結(jié)合，這種雙價(jià)結(jié)合產(chǎn)生了功能親合力(Aidity)。

為了研究TRIM21與IgG的結(jié)合動(dòng)態(tài)，研究人員首先采用兩種重組TRIM21構(gòu)建體，同時(shí)構(gòu)建了包含PRYSPRY和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的TRIM21-CC-PS的結(jié)構(gòu)，來(lái)模擬TRIM21的天然二聚體狀態(tài)。然后通過(guò)SPR的方法測(cè)試TRIM21與一系列human IgG1 (mAb1)突變體的親和力。

Interaction analysis of human IgG1 (mAb1) Fc variants and TRIM21 PRYSPRY domain

 
實(shí)驗(yàn)結(jié)果展示了抗體Fc端具有雙價(jià)態(tài)結(jié)合功能可以與兩個(gè)TRIM21結(jié)合，利用單分子質(zhì)量光度系統(tǒng)不但可以確認(rèn)SPR的測(cè)試結(jié)果，而且由于TRIM21天然形成同源二聚體具有比傳統(tǒng)1:1相互作用更為復(fù)雜的結(jié)合模式，質(zhì)量光度系統(tǒng)具有更大的優(yōu)勢(shì)來(lái)測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量比。

大多數(shù)抗體構(gòu)建體對(duì)PRYSPRY的親和力是相似的，但是結(jié)合界面的關(guān)鍵殘基上含有Fc突變的變體YTE（M252Y, S254T, T256E）、HH（T307H, N434H）和Y436A，對(duì)PRYSPRY結(jié)構(gòu)域的親和力比野生型（WT）更低一些，結(jié)合強(qiáng)度順序如下：WT具有最強(qiáng)的親和力，其次是YTE，然后是HH，Y436A的親和力最弱。研究人員還發(fā)現(xiàn)Y436A與野生型相比親和力降低了180倍，SPR和單分子質(zhì)量光度系統(tǒng)（MP）結(jié)果揭示了PRYSPRY-IgG的化學(xué)計(jì)量比為2:1，且沒(méi)有表現(xiàn)出任何結(jié)合協(xié)同性，沒(méi)有顯示Fab結(jié)合的額外貢獻(xiàn)。

Mass distribution of Fc WT / cytokine-Fc Fusion WT / cytokine-Fc Fusion WT-AAA

Mass distribution of cytokine-Fc Fusion WT / WT-AAA / Y436A

研究人員隨后進(jìn)一步確定了TRIM21-CC-PS二聚體的狀態(tài)，二聚體結(jié)構(gòu)的預(yù)期理論分子量是86千道爾頓。體積排阻色譜-多角光散射（SEC-MALS）顯示，94%的顆粒質(zhì)量約為90千道爾頓。質(zhì)量光度測(cè)量（MP）顯示99%的顆粒重量為82 ± 13千道爾頓。電子顯微鏡分析揭示，PRYSPRY結(jié)構(gòu)域彼此相對(duì)，卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域在中間介導(dǎo)其二聚體化。

Dimer of TRIM21-CC-PS determined by MP and EM

為了深入研究TRIM21-CC-PS與抗體Fc的結(jié)合模式，研究人員進(jìn)一步采用了單分子質(zhì)量光度系統(tǒng)和EM兩種技術(shù)。在MP測(cè)量中，將不同濃度遞增的TRIM21-CC-PS與三種抗體Fc變體（mAb1 WT、mAb1 WT-AAA和mAb1 AAA）分別以不同的摩爾比例孵化。將TRIM21-CC-PS與mAb1混合后，出現(xiàn)了大約80 kDa和140 kDa的峰，分別代表未結(jié)合的TRIM21-CC-PS和mAb1。在大約230 kDa處出現(xiàn)了第三個(gè)峰，其分子量對(duì)應(yīng)于由一個(gè)TRIM21-CC-PS和一個(gè)mAb1 WT組成的復(fù)合物。隨著TRIM21-CC-PS濃度的增加，平衡向結(jié)合物種轉(zhuǎn)移直到幾乎所有的抗體都被結(jié)合。在TRIM21-CC-PS的10倍摩爾過(guò)量下，24%的TRIM21-CC-PS和mAb1 WT結(jié)合，揭示了1:1的化學(xué)計(jì)量比，其中一個(gè)二聚體同時(shí)與兩個(gè)IgG重鏈結(jié)合。在低納摩爾濃度下檢測(cè)TRIM21-CC-PS與mAb1 WT的相互作用，也使研究人員洞察到了二聚體結(jié)合導(dǎo)致的強(qiáng)烈相互作用，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)功能親合力(Avidity)結(jié)合模式。
 
另外，mAb1 WT-AAA濃度顯示了很小一部分結(jié)合分?jǐn)?shù)（約2%），而AAA變體則沒(méi)有形成復(fù)合物。有意思的是研究人員預(yù)期mAb1 WT-AAA變體會(huì)有結(jié)合，但是實(shí)驗(yàn)中只觀察到兩個(gè)Fc重鏈中的一個(gè)結(jié)合導(dǎo)致了親和力變?nèi)�，而�?duì)稱(chēng)的AAA突變完全取消了TRIM21的結(jié)合。值得注意的是，數(shù)據(jù)表明TRIM21可以通過(guò)與一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)與A20抗體的兩個(gè)不同F(xiàn)c區(qū)域的同時(shí)相互作用，從而最終誘導(dǎo)AAV顆粒聚集。

Investigate the TRIM21-CC-PS - Antibody Fc binding mode by MP

在低納摩爾濃度下檢測(cè)到TRIM21-CC-PS與mAb1野生型之間的相互作用，正如在AlphaFold模型（Uniprot ID P19474）中所觀察到的，PRYSPRY結(jié)構(gòu)域通過(guò)一個(gè)柔性連接鏈附著在其螺旋上。這個(gè)連接鏈可能通過(guò)將PRYSPRY結(jié)構(gòu)域彼此拉近，允許二聚體結(jié)合。

最后，研究人員探索了TRIM21與重組腺相關(guān)病毒載體(rAAVv)顆粒之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)通過(guò)TRIM21的參與來(lái)介導(dǎo)目標(biāo)結(jié)合（AAV）和效應(yīng)功能實(shí)現(xiàn)功能親合力，展示了這些相互作用的多面性。

綜上所述Roche科研人員的這些發(fā)現(xiàn)揭示了TRIM21在抗病毒免疫中的雙重作用，既識(shí)別、引導(dǎo)病毒進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)降解，也展示了其在細(xì)胞內(nèi)中和的病毒感染治療中上的潛力。該研究推進(jìn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)免疫反應(yīng)的理解，并為利用TRIM21獨(dú)特結(jié)合模式開(kāi)發(fā)抗病毒策略和創(chuàng)新設(shè)計(jì)開(kāi)辟了新途徑。
 
Reference:
Reusch J, et al. TRIM21 and Fc-engineered antibodies: decoding its complex antibody binding mode with implications for viral neutralization. Front Immunol. 2024 Jun 12;15:1401471.
 

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