冠狀病毒及其離心分離

  冠狀病毒及其離心分離

YU.2003.4

一、冠狀病毒概述：

冠狀病毒是引起感冒的主要病原，它只感染脊椎動(dòng)物，可引起人與動(dòng)物的呼吸道、消化道與神經(jīng)系統(tǒng)病患。冠狀病毒的代表株早已被科學(xué)家查明，典型的如B814(1965,Tyrrell),229E(1996, Hamre),OC 43(1967,Melntosh)等等，此后，Almeida對(duì)冠狀病毒時(shí)完整形態(tài)進(jìn)行了研究發(fā)現(xiàn)在它的脂質(zhì)膜的外表面分布著類(lèi)似日冕形狀的纖突，故命名為冠狀病毒。我國(guó)在1975年正式命名。目前流行的非典肺炎的病源，根據(jù)已完成的病毒基因圖譜排列（E.S.M.N蛋白，多聚酶及3CL蛋白水解酶和核苷酸序列）表明它是新發(fā)現(xiàn)的變異冠狀病毒，可能是動(dòng)物傳給人類(lèi)的。冠狀病毒和其他危害人類(lèi)的病毒一樣，只有當(dāng)它同細(xì)胞（或細(xì)菌）結(jié)合時(shí)才能獲得一些生命系統(tǒng)的特征。通常它是以微小的傳染顆粒的形式（病毒粒子）在細(xì)胞內(nèi)傳播。他的化學(xué)組成主要是核酸和蛋白質(zhì)。幾何尺寸為100~200nm，沉降系數(shù)700S~800S，在蔗糖液中的浮密度約為1.15~1.19�？梢杂秒娮语@微鏡來(lái)觀察它的顆粒的完整形狀和尺寸，進(jìn)一步還可以觀察到他的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

 冠狀病毒外形通常為近似球形。核酸位于中心部。最外部為纖突，是血凝素和神經(jīng)胺酸酶的蛋白大分子，他附著在具有保護(hù)作用的脂質(zhì)膜上。纖突是在病毒侵害人體細(xì)胞時(shí)附著到細(xì)胞上的吸附器。同時(shí)也是中和抗體的抗原。脂質(zhì)膜往內(nèi)依次是膜蛋白層。螺旋殼膜子粒、核酸鏈。

 冠狀病毒的核酸為雙股線型RNA，同種冠狀病毒的核酸序列是恒定的，但是病毒發(fā)生變異后其核酸與蛋白的序列也會(huì)發(fā)生某些微小的變化。

 冠狀病毒的生命周期中可見(jiàn)二個(gè)階段交替存在：即細(xì)胞外階級(jí)和細(xì)胞內(nèi)階級(jí)。細(xì)胞外階級(jí)是以病毒粒子的狀態(tài)存在，即線型核酸外包著蛋白質(zhì)殼膜；細(xì)胞內(nèi)階級(jí)是以RNA形式存在，即當(dāng)病毒核酸進(jìn)入人體寄主細(xì)胞后，將引起病毒核酸的復(fù)制和特異病毒蛋白的合成。特異病毒蛋白包括組成病毒的殼膜和子粒的合成。由于冠狀病毒的核酸是RNA，所以它既可以直接作為m RNA也可以轉(zhuǎn)錄形成一個(gè)互補(bǔ)的RNA股。冠狀病毒進(jìn)入人體寄主細(xì)胞后其信息通過(guò)人體細(xì)胞生物合成機(jī)構(gòu)提供產(chǎn)能系統(tǒng)、核蛋白體、氨基酸活化酶、t RNA和其他組分來(lái)指導(dǎo)合成一系列的冠狀病毒蛋白，其中重要的有病毒核酸復(fù)制所需要的酶及病毒殼膜內(nèi)的子粒。再進(jìn)一步，冠狀病毒核酸自身作為復(fù)制的模板在特異聚合酶的作用下復(fù)制，并用上述由病毒核酸指導(dǎo)合成的病毒蛋白集裝成殼膜包圍成一個(gè)新的冠狀病毒顆粒，從而進(jìn)一步破壞人體的組織。

二、病毒的分離純化：

i.取感染組織制成勻漿，普通低溫離心機(jī)3000rpm x 20分，棄去沉淀。

ii.取上清液少許滴在裝有火棉膠膜的銅網(wǎng)上，濾紙吸干后吹干，浸在2%醋酸鈾中染色，然后在透射電鏡中初步觀測(cè)，確認(rèn)是否有病毒存在，如有，上清液作進(jìn)一步離心分離。

 iii.清液作等密度離心分離，日立P40ST或其它品牌類(lèi)似甩平轉(zhuǎn)頭，6 x 13ml，用薄壁PA管，12ml  10~50%蔗糖（分析純）連續(xù)線性梯度，蔗糖梯度液表面鋪上清液至距離心管口3mm，33000rpm  1小時(shí)，5℃。病毒應(yīng)沉降在36%蔗糖梯度附近。離心完畢后取出離心管靜置于試管架內(nèi)，用上取法[日立DGF-U 密度梯度制備及片斷收集儀（本身帶管道泵）]，梯度儀泵出口連接到帶流動(dòng)池的分光光度計(jì)，連續(xù)測(cè)定離心管中從上至下各層次的吸光度（波長(zhǎng)280nm~340nm需試驗(yàn)，優(yōu)化）用記錄儀或打印機(jī)繪出分層容量——吸光度曲線，病毒的峰顯而易見(jiàn)。經(jīng)過(guò)分光光度計(jì)的流動(dòng)池后，每個(gè)離心管分部收集成50~100管，根據(jù)吸光度曲線中病毒峰位置可知病毒分布在哪（幾）個(gè)離心管中，透析去蔗糖，可得到純病毒樣品。

 iv.參照“生物大分子加密度梯度離心”用等密度離心法或速率一區(qū)帶密度梯度離心法分離純化病毒的蛋白和RNA并可作進(jìn)一步測(cè)序研究。

作者：余興明   電話：13764301893,