“質(zhì)粒DNA超速離心分離”的補(bǔ)充說明

  “質(zhì)粒DNA超速離心分離”的補(bǔ)充說明 

一）用CSCL-E.B.梯度分離大腸桿菌中質(zhì)粒DNA、染色體DNA、蛋白質(zhì)及RNA的詳細(xì)步驟

（1）    溶液制備：

溶液Ⅰ：50mM葡萄糖，10mM EDTA,25 mM Tris-HCL (PH8.0)。

溶液Ⅱ：0.2M NaOH，1%SDS。

溶液Ⅲ：3M醋酸鈉（PH4.8）

TE緩沖液：10 mM Tris-HCL (PH7.4)，2mM EDTA

（2）    E.coli培養(yǎng)液1升。（實(shí)驗(yàn)應(yīng)用時可按比例增加或減少）

（3）    將1L培養(yǎng)液在4000rmp（約20000xg），5℃離心20分鐘，得到細(xì)菌沉淀。

（4）    用100ml冷的溶液Ⅰ洗沉淀，再離心，4000rmp，5℃離心20分。

（5）    用20ml冷的溶液Ⅰ將第二次沉淀調(diào)成均勻懸浮液。

（6）    每ml加入2mg溶菌酶，并在0℃冰中放置10分鐘。

（7）    加入40ml溶液Ⅱ，輕輕攪拌后在冰浴中置5分鐘。

（8）    加入30ml溶液Ⅲ，在冰浴中放置20分鐘，使蛋白質(zhì)大部分沉降。

（9）    在高速冷凍離心機(jī)上，用角式轉(zhuǎn)頭10000rmp（約10000xg）離心15分鐘，5℃。

（10）小心地倒去上清（不攪拌沉淀）。在沉淀中加入55ml異丙醇（Isopropanol），即得到粗制的質(zhì)粒DNA溶液。

（11）粗制DNA液在-20℃。在重力狀態(tài)下沉淀15分鐘以上，再在12000rpm（15000xg）4℃離心5分鐘，倒去上清液。

（12）真空中抽去異丙醇，沉淀中加入18ml經(jīng)消毒過的TE緩沖液，在沉淀溶解后，再加入0.65ml 1%的E.B.（共約35ml-40ml）。

（13）以上溶液每ml加入分析純CSCL1.0克，并使其完全溶解，檢測溶液折射率應(yīng)為1.3890（ρ=1.587）

（14）用以上溶液作質(zhì)粒DNA的超速離心分離，用12ml，PA密封管，角轉(zhuǎn)頭100000xg36hr，20℃，小傾角轉(zhuǎn)頭78000rpm x 4hr或垂直管轉(zhuǎn)頭350000xg 6hr，20℃

（15）離心后，在紫外光下（最好用300nm紫外光，對DNA損傷最�。�，可顯示DNA帶（即線性DNA帶與質(zhì)粒DNA帶），RNA沉淀底部，蛋白質(zhì)浮在頂部。

（16）用切管器切去管上部，抽出質(zhì)粒DNA（管中部附件，有二個帶，上部是線性DNA帶，下部是質(zhì)粒DNA帶）。

      也可以直接從側(cè)壁穿刺抽出質(zhì)粒DNA

      最好是用梯度儀用上取法自上而下抽出后經(jīng)流動池測OD，繪出ABS曲線，再分部收集。

（17）從溶液中抽提E.B.用透析法或脫鹽柱去CSCL。

（18）如果不用E.B.可以用三氟醋酸銫作為梯度介質(zhì)。但不可用E.B.時，分離后看不出質(zhì)粒DNA帶位置，三氟醋酸銫離子吸收紫外線，使分析更困難，此法不常用。

二） E.B.（ethidium bromide,溴化乙錠）的作用

（1）降低了DNA在CSCL中浮密度，以SV 40 DNA為例，無E.B.時，其在CSCL中浮密度為1.71，有E.B.時降為1.575。減少了CSCL使用量，縮短了離心時間，降低了離心成本。

（2）使質(zhì)粒DNA純樣品帶在紫外光照射下顯色，從而在超速分離后易于識別Plasmid DNA帶的位置，便于抽出。

（3）E.B.的存在使質(zhì)粒DNA與線粒體DNA在CSCL中的浮動密度差減少。使二個帶靠得較近。但用超離心分離方法，還是可以將二種DNA分開。（線性DNA與質(zhì)粒DNA在CSCL中浮密度分別為1.532和1.575）。

作者：余興明   電話：13764301893,