用順序浮選法快速分離血清脂蛋白

 

用超速離心機(jī)分離血清脂蛋白，常用順序浮選法（Sequence floating）和單次垂直管分離法(SVS),各種轉(zhuǎn)速和容量都可以做，下面介紹一種簡單、快捷的微量固定角式轉(zhuǎn)頭分離法，結(jié)果可供研究與臨床分析。

 

一）設(shè)備：

          ● 日立CS150GXL 制備型微量超速離心機(jī)

          ● 轉(zhuǎn)頭：S140AT 固定角式轉(zhuǎn)頭，Nmax＝140,000rpm，RCFmax＝1,050,000(xg)，最大容量10×2ml

          ● 離心管：1ml 聚碳酸脂（PC）全透明厚壁管

 

二）溶液配置：

A液：（密度＝1.006克/毫升）。11.4克NaCl，0.1克EDTA-2Na置于1,000ml量筒，加500ml重蒸水及1ml 1N NaoH，充分混合直至全部溶解，加重蒸水至1,000ml，再加3ml重蒸水（NaCl含量為0.195mol）

B液：（密度=1.182克/毫升），取100ml A液，加入NaBr 24.98克（Nacl：0.195mol.，NaBr：2.44mol.）

C液：（密度＝1.478克/毫升），取100ml A液，加NaBr 78.32克（NaCl＝0.195mol. NaBr:7.65mol.）

 

三）其他：

樣品：禁食后抽取的靜脈血，低速離心去血球（不禁食抽取的血液中含乳麋粒-Chylomicrom第一次離心后會浮在VLDL之上）。

顯色劑：脂肪紅7B（FAT RED 7B），便于肉眼觀察。

 

四）離心分離：

I．VLDL（密度＜1.006克/毫升）分離

1 PC厚壁管，下部為血清600μl，上部為300μl A液

離心：140,000rpm，16℃，50分鐘，加速“5”，減速“7”

結(jié)果：VLDL 浮在液面，有顯見的一薄層

 

II．LDL（1.006克/毫升＜密度＜1.063克/毫升）分離

第（I）次離心后的PC管，抽去上部含VLDL的溶液300μl。抽去VLDL后，在剩余的液體（約600μl）上加入300μl溶液B，并充分混勻。

離心：140,000rpm，16℃，80分鐘，加速“9”，減速“7”

結(jié)果：液面上浮著一層LDL（含有IDL）下部為HDL與血清蛋白混合液。

 

III．HDL（1.063克/毫升＜密度＜1.21克/毫升）分離

第（II）次離心后的PC管抽去上部含LDL的溶液300μl，抽去LDL后在剩余的液體（約600μl）中加入300μl 溶液C，充份混勻。

離心：140,000rpm，16℃，140分鐘，加速“9”，減速“7”

結(jié)果：液面上浮面一層HDL，下部是血清白蛋白和球蛋白。