超速區(qū)帶轉(zhuǎn)頭的二次病毒純化

 

設(shè)備：日立CP-70MX或CP-70ME超速離心機

      P35ZT區(qū)帶轉(zhuǎn)頭，RPZ-S密封加樣器，Master-flex 軟管泵（流量100—1000ml/分）

樣品：用雞胚培養(yǎng)后收集的尿囊液，予冷至4℃左右（流感病毒，仙臺病毒或其他）

 

1.       已培養(yǎng)好的雞胚（蛋）用75％酒精消毒；

2.       人工或機械（自動）收集雞胚尿囊液，按雞蛋大小收集量略有不同（每只6-8ml）；

3.       初濾：10μm濾芯過濾；

4.       連續(xù)流離心或超濾系統(tǒng)過濾；

A.     連續(xù)流離心：日立R13C連續(xù)流轉(zhuǎn)頭，12,000rpm，流速600－800ml/分，上清液用于透析濃縮

B.      Millipore超濾系統(tǒng)：0.45μm濾膜

5.       透析濃縮：用Millipore超濾器，1000KD膜包。

濃縮后通常為尿囊液的1/30－1/40

濃縮后液體用于超速離心分離純化。

 

 

 

Ⅰ. 轉(zhuǎn)頭低速旋轉(zhuǎn)：2000rpm—3000rpm，4℃，予冷（轉(zhuǎn)頭也可以在冰箱中予冷過夜）

Ⅱ. 從轉(zhuǎn)頭外壁依次注入：65ml PBS（磷酸緩沖液），1000ml予處理后的尿囊液（予冷4℃），130ml 30％（w/w）蔗糖液，然后用55％（w/w）蔗糖液充滿轉(zhuǎn)頭（約450ml—500ml）（蔗糖液配置后放在4℃冰箱中予冷待用）

Ⅲ. 拆除加樣頭，裝上密封蓋

Ⅳ. 關(guān)閉離心蓋板，抽真空，轉(zhuǎn)頭加速到32,000rpm（100,000xg）,4℃，150分鐘

Ⅴ. 超速離心完成后轉(zhuǎn)速下降至（2000—3000）rpm，中心孔管道接到分光光度計的標(biāo)準(zhǔn)流動池。流動池出口接分部收集器。

Ⅵ. 用60％（w/w）的蔗糖從轉(zhuǎn)頭外側(cè)泵入?yún)^(qū)帶轉(zhuǎn)頭，從中心孔依次排出第一次離心后的各個組份

Ⅶ. 排出的液體直接輸入到分光計或蛋白核酸分析儀的標(biāo)準(zhǔn)流動池并連續(xù)測定O.D.值，測定后收集。

Ⅶ. 病毒沉降在30％與55％蔗糖梯度之間的某個界面附近，分光計用280nm波長檢測O.D.值，在分光光度計的顯示屏上或打印機上繪出轉(zhuǎn)頭的容量—O.D.值曲線。在高、低密度蔗糖梯度液之間有一個病毒峰。30％--55％蔗糖在離心后由于濃度擴散在原界面附近已形成了一個連續(xù)的密度梯度�！究梢栽诜植渴占�后（約50管）用阿貝折射儀（4℃恒溫）測定每管的光折射率并對照查出4℃時的蔗糖密度，繪出蔗糖密度曲線】，而O.D.曲線峰頂?shù)奈恢脤��?yīng)著某個蔗糖的密度。

Ⅷ. 根據(jù)峰的位置認(rèn)定病毒所在離心管

Ⅸ. 留取約150ml病毒液4—5℃儲存待用

Ⅹ. 重復(fù)（Ⅰ—Ⅷ）的過程再做二次病毒的分離和收集，三次離心共收集粗制病毒液500--550ml，4℃-- 5℃保存待用

 

Ⅰ. 將第一組三次離心后收集的粗制病毒液配置成20％（或25％）低密度蔗糖液（w/w）

Ⅱ. 第一組離心后的區(qū)帶轉(zhuǎn)頭停轉(zhuǎn)后倒出濃（60％w/w）蔗糖（可以重復(fù)使用），清潔后，再安裝到離心機上低速旋轉(zhuǎn)（4℃）予冷

Ⅲ. 從轉(zhuǎn)頭外側(cè)依次泵入：130ml PBS，550ml在（20％或25％）蔗糖中的病毒粗制液，600ml 30％蔗糖液，約410—420ml  55％（w/w）蔗糖液（以上液體均予冷到4℃左右再泵入）

Ⅳ. 加樣完畢后卸下加樣器，裝上密封蓋，關(guān)門，抽真空，轉(zhuǎn)頭加速到32,000rpm（約100,000xg）,240分鐘，4℃

Ⅴ. 重復(fù)第一組（Ⅳ—Ⅵ）步驟，分步收集成50管，經(jīng)250nm，O.D.值連續(xù)測定，可以看出在比第一組峰頂相對應(yīng)的蔗糖梯度略高的位置形成很尖銳的病毒峰�？梢允杖〖s120ml高純度的病毒液

Ⅵ. 最終的蔗糖密度梯度分布呈現(xiàn)連續(xù)的有近似臺階形狀的密度分布。O.D. 峰位于離心前30％與55％（w/w）界面稍靠外位置

 

Ⅰ.也可以用PBS來配置不同密度蔗糖液

Ⅱ. 用阿貝折射儀測蔗糖密度時樣品溫度應(yīng)保持在4℃

Ⅲ. 由于轉(zhuǎn)頭和加樣系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的差異，使用Beckman Ti—15轉(zhuǎn)頭（32,000rpm,102,000xg）時，泵入高密度蔗糖（55％w/w）和用60％(w/w)蔗糖液泵出時進出樣的速度必須很慢，否則很容易產(chǎn)生內(nèi)漏（即已分離好的樣品和高濃度蔗糖混合而使離心失敗）。使用日立P35ZT區(qū)帶轉(zhuǎn)頭（35,000rpm，122,000xg）和Beckman Ti—15區(qū)帶轉(zhuǎn)頭時要特別注意主機和加樣系統(tǒng)的水平調(diào)整和離心后轉(zhuǎn)動部件的清洗與潤滑，這些操作對防止漏液、延長轉(zhuǎn)動摩擦密封的壽命（熟練的操作者可以使一個密封器工作150次或更多，不熟練的隨意操作可能使昂貴的摩擦密封只能工作15—20次）非常重要

Ⅳ. 以上介紹的離心方法也適用于超速連續(xù)流轉(zhuǎn)頭分離（Hitachi P32CT系統(tǒng)，Beckman CF—32Ti系統(tǒng)，Sorvall TCF—32系統(tǒng)—Sorvall采用Hitachi OEM的Discovery SE或Ultra－WX系列超速離心機），稍有區(qū)別的是在加速到分離轉(zhuǎn)速后（一般為28,000rpm—32,000rpm）先排出近轉(zhuǎn)頭中心的PBS液再以每小時0.8—1.5升的速度連續(xù)泵入尿囊液或組織培養(yǎng)液。每次離心可處理（4—6）升樣品。根據(jù)第一組分離的結(jié)果（病毒的純度和含量）決定是否進行第二組分離。

Ⅴ. 如果需要處理的樣品量達到20升/24小時或更多時，可考慮使用日立大容量超速連續(xù)流系統(tǒng)CC-40（40,000rpm，118,000xg，最大流量50升/小時，病毒純化常用流量8升/小時—12升/小時）或CC-40S，應(yīng)用的蔗糖梯度、緩沖液及分離程序與一般超速連續(xù)流相似。從操作者的角度比較，以上三種設(shè)備：CC—40自動化程度最高，操作簡易；區(qū)帶次之；一般超速連續(xù)流系統(tǒng)對操作者要求較高

Ⅵ. 較低密度蔗糖液的用量和每次處理的樣品量及樣品的病毒濃度有關(guān)。處理樣品量大，病毒濃度低，則30％（w/w）蔗糖量較少，反之則應(yīng)增加用量

Ⅶ. 制備區(qū)帶梯度和加樣的進液速度約為50ml—200ml/分，出樣速度為100ml/分左右，某些機型的進出樣速度可能要降低到20—50ml/分。

 

作者：余興明   電話：13764301893,