xCELLigence系統(tǒng)實(shí)時(shí)檢測(cè)神經(jīng)毒性

xCELLigence系統(tǒng)持續(xù)檢測(cè)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)

Sebastian Diemert, Julia Grohm, Svenja,Tobaben, Amalia Dolga, Carsten Culmsee
德國(guó)，馬爾堡大學(xué)，藥理學(xué)與臨床藥學(xué)研究所

    摘要：為了研究類神經(jīng)元細(xì)胞HT-22，及原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞對(duì)不同細(xì)胞死亡刺激物的反應(yīng)，我們使用由羅氏與ACEA Biosciences公司聯(lián)合開發(fā)的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系統(tǒng)，應(yīng)用非侵入式、無標(biāo)記性技術(shù)，對(duì)類神經(jīng)元細(xì)胞HT-22進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。研究表明，通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞粘附與細(xì)胞增殖的監(jiān)測(cè)，xCELLigence系統(tǒng)可對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)并追蹤細(xì)胞的變化及其死亡情況。

關(guān)鍵詞：神經(jīng)細(xì)胞死亡、xCELLigence系統(tǒng)、原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞、HT-22 細(xì)胞、細(xì)胞阻抗、實(shí)時(shí)測(cè)定

前言

    在很多神經(jīng)退化性疾病中發(fā)現(xiàn)了神經(jīng)元凋亡與壞死。近幾年來，神經(jīng)科學(xué)研究中建立了幾種細(xì)胞培養(yǎng)模式，用于體外細(xì)胞死亡機(jī)制的研究。盡管近年來科學(xué)界對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞死亡信號(hào)傳導(dǎo)原理已經(jīng)得了一定成果，但技術(shù)上的局限性依然存在，從而限制了對(duì)數(shù)據(jù)的采集與解讀。而無法進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞死亡的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)是一個(gè)主要的技術(shù)瓶頸。目前為止，主要的細(xì)胞增殖、細(xì)胞生存與細(xì)胞死亡檢測(cè)方法均為侵入式終點(diǎn)檢測(cè)，通常對(duì)細(xì)胞有毒性，并需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行破壞處理。
    同時(shí)，對(duì)神經(jīng)細(xì)胞死亡與潛在機(jī)制進(jìn)行動(dòng)態(tài)變化分析，需要大量的實(shí)驗(yàn)操作，涵蓋持續(xù)的、多個(gè)時(shí)間點(diǎn)。目前有幾種終點(diǎn)實(shí)驗(yàn)法，可進(jìn)行特定凋亡時(shí)間點(diǎn)上的特異性分子事件的檢測(cè)，如磷脂酰絲氨酸轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜外部，線粒體功能障礙、半胱氨酸蛋白酶激活，以及 DNA 斷裂[1]。這些終點(diǎn)測(cè)定的一個(gè)缺陷是，其無法確定實(shí)驗(yàn)凋亡時(shí)間點(diǎn)。為解決這個(gè)問題，研究人員需要重復(fù)對(duì)細(xì)胞死亡形態(tài)學(xué)改變進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
    目前，使用由羅氏與 ACEA Biosciences公司聯(lián)合開發(fā)的實(shí)時(shí)細(xì)胞分析儀（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系統(tǒng)，應(yīng)用非侵入式、無標(biāo)記性技術(shù)，可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。xCELLigence系統(tǒng)對(duì)將傳感器微電極點(diǎn)陣整合入E-Plate 96培養(yǎng)孔底部，并對(duì)生長(zhǎng)于上的細(xì)胞阻抗進(jìn)行記錄。阻抗測(cè)定記錄的是細(xì)胞指數(shù)（Cell Index，CI）值，細(xì)胞貼附于電極后，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，會(huì)導(dǎo)致電流環(huán)路電阻改變，該電阻與細(xì)胞指數(shù)具有相關(guān)性。通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變、細(xì)胞粘附與細(xì)胞增殖的監(jiān)測(cè)，xCELLigence 系統(tǒng)可追蹤細(xì)胞變化與細(xì)胞死亡情況。
    本研究中，我們使用xCELLigence系統(tǒng)，對(duì)類神經(jīng)元細(xì)胞HT-22，及原代培養(yǎng)大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，對(duì)不同細(xì)胞死亡刺激物的反應(yīng)進(jìn)行了研究。原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞的一個(gè)特征是其濃密的樹突狀網(wǎng)絡(luò)，該網(wǎng)絡(luò)在凋亡誘導(dǎo)后，可殘留于組織反應(yīng)板上。無論細(xì)胞本身是否已發(fā)生凋亡，凋亡神經(jīng)元可殘留貼附于細(xì)胞培養(yǎng)板上，并顯示出一定的阻抗性。這種特性對(duì)原代神經(jīng)元培養(yǎng)監(jiān)測(cè)的影響，也是本次使用RTCA儀器進(jìn)行研究的一個(gè)熱點(diǎn)。而且，我們對(duì)xCELLigence系統(tǒng)對(duì)神經(jīng)保護(hù)作用的監(jiān)測(cè)能力進(jìn)行了研究。出于這個(gè)目的，我們使用神經(jīng)保護(hù)劑BI-6C9，BI-6C9是一種公認(rèn)的BH-3 小分子抑制劑，可與死亡激動(dòng)劑（domain death agonist，BID）發(fā)生相互作用，是Bcl-2基因家族的預(yù)凋亡成員[4, 5]。
    總之，研究表明，xCELLigence系統(tǒng)可通過多方面實(shí)驗(yàn)，持續(xù)對(duì)神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)包括接種反應(yīng)板、預(yù)培養(yǎng)、增殖膠質(zhì)細(xì)胞的去除、藥物作用，以及對(duì)神經(jīng)毒性與神經(jīng)保護(hù)作用的確認(rèn)。

1 材料與方法
1.1 HT-22類神經(jīng)元細(xì)胞
    按照指定密度接種HT-22細(xì)胞于96孔 E-反應(yīng)板96（羅氏）或常規(guī)96-孔反應(yīng)板（Greiner，F(xiàn)rickenhausen）上，并生長(zhǎng)于DMEM培養(yǎng)基（德國(guó) Karlsruhe, Invitrogen 公司）中，培養(yǎng)基中添加有10%熱失活胎牛血清（FCS）、100 U/ml 青霉素、100 µg/ml鏈霉素與2 mM 谷氨酸（德國(guó) PAA Laboratories 有限公司）。
1.2 原代皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)
    如前述，原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞來自于胎鼠大腦（E16-18）[4]。簡(jiǎn)言之，即分離皮質(zhì)組織、輕柔胰酶消化后，機(jī)械分離神經(jīng)元，并去除腦膜。將不同密度細(xì)胞接種于聚乙烯亞胺 （polyethylenimine，PEI） 預(yù)包被 96-孔 E-Plates 96（Roche）或標(biāo)準(zhǔn) 96-孔板（Greiner）中。培養(yǎng)基為神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)基 （Invitrogen） 添加有5mM HEPES、1.2 mM 谷氨酸、2% （v/v） B27 補(bǔ)充劑（Invitrogen）與慶大霉素（0.1 mg/ml）。培養(yǎng) 48 小時(shí)后，使用胞嘧啶-阿糖胞苷（cytosine-arabinofuranoside，CAF）處理 48 小時(shí)，抑制非神經(jīng)元細(xì)胞的生長(zhǎng)。然后，體外培養(yǎng) 6-7 天后，完全更換培養(yǎng)基，將神經(jīng)元細(xì)胞用于下述實(shí)驗(yàn)。為對(duì)谷氨酸處理神經(jīng)元細(xì)胞CI 值的改變進(jìn)行監(jiān)測(cè)，必須于培養(yǎng)第0天，于細(xì)胞中添加 1 µM CAF。
1.3 細(xì)胞增殖檢測(cè)
    根據(jù)細(xì)胞增殖試劑盒I（MTT）（羅氏）的說明書，通過比色MTT（3-[4,5-二甲基砷-2-yl] -2,5-溴化噻唑藍(lán)四氮唑） 檢測(cè)，對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)。通過自動(dòng)FLUOstar Optima 讀取儀（德國(guó) Offenburg ，BMG Labtech）進(jìn)行 570 nm培養(yǎng)孔的吸光度讀取，參考過濾波長(zhǎng)是 630 nm。
1.4 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析
    使用 xCELLigence RTCA MP 儀器與 RTCA 軟件1.2 進(jìn)行 CI 值測(cè)定，并于 E-Plate 96 中進(jìn)行持續(xù)監(jiān)測(cè)。用100 µl DMEM含10% FCS進(jìn)行HT-22細(xì)胞培養(yǎng)的背景阻抗檢測(cè)，用100 µl 神經(jīng)細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基含2% B27進(jìn)行神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)的背景阻抗檢測(cè)。PEI 包被不會(huì)干擾細(xì)胞阻抗測(cè)定。相反，多聚-D-賴氨酸或多聚-L-賴氨酸包被可顯著干擾原代皮質(zhì)神經(jīng)元的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。對(duì) HT-22 細(xì)胞持續(xù)監(jiān)測(cè) 2 天，對(duì)原代皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞持續(xù)檢測(cè) 12-14 天。
1.5 熒光與光學(xué)顯微鏡
    在PEI包被 IbiTreat µ-Slide 8-孔反應(yīng)板（德國(guó)Munich，Ibidi） 上培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞，培養(yǎng) 6 天。然后，將培養(yǎng)細(xì)胞固定于 +4°C 磷酸緩沖液（PBS）（pH 7.4） 多聚甲醛中。使用 0.2% Triton X-100/PBS 對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行透化處理，使用 10% （v/v） 標(biāo)準(zhǔn)山羊血清（NGS）與2% （v/v） 牛血清白蛋白 （BSA）PBS，于室溫處理 1 小時(shí)進(jìn)行終止。+4°C 環(huán)境下，將神經(jīng)元細(xì)胞與神經(jīng)元標(biāo)志微管相關(guān)蛋白2 (microtubule-associated protein 2，MAP-2） （英國(guó)劍橋Abcam, ab11267, HM-2, 1:600 稀釋）小鼠單克隆抗體共同孵育，孵育過夜。第2 天，將細(xì)胞與山羊抗小鼠二抗（Alexa Fluor® 488 goat anti-mouse IgG （H+L） (Invitrogen, 1:250 稀釋）共同孵育。使用DMI6000 B 倒置顯微鏡（德國(guó)，Leica ）收集熒光成像信息，LAS AF 軟件（德國(guó)Mannheim，Leica Microsystems 公司Leica Application Suite, Advanced Fluorescence 2.2.0）分析。使用配備有 Lumenera Infinity 2 數(shù)字?jǐn)z象機(jī)（加拿大 Ottawa，Lumenera 公司）的Axiovert 200 顯微鏡（德國(guó) Jena ，Carl Zeiss ）獲取光學(xué)顯微鏡的成像信息。10x 2.5 NA 物鏡 （德國(guó) Jena ，Carl Zeiss）采光，通過相差進(jìn)行成像捕獲。INFINITY ANALYZE 軟件 （Lumenera 公司） 數(shù)字成像記錄與成像分析。

3 結(jié)果
3.1 神經(jīng)元 HT-22 細(xì)胞增殖
    為對(duì)神經(jīng)細(xì)胞系 HT-22 的生長(zhǎng)與增殖情況進(jìn)行評(píng)價(jià)，將細(xì)胞以不同密度（4500、8000 
與 20000 細(xì)胞每孔） 接種于 E-Plate 96 上，并使用xCELLigence RTCA MP 儀器進(jìn)行監(jiān)測(cè)，監(jiān)測(cè) 48 小時(shí)。首先細(xì)胞粘附于培養(yǎng)孔表面后，阻抗會(huì)顯著增加，后期實(shí)驗(yàn)中，HT-22 細(xì)胞增長(zhǎng)穩(wěn)定。最終的各生長(zhǎng)曲線，斜率非常相似，僅各培養(yǎng)孔絕對(duì) CI 值不同，CI 值隨各自接種密度的（參見圖 1A 與 B）不同而不同。

    為進(jìn)行 HT-22細(xì)胞死亡誘導(dǎo)，使用不同劑量的谷氨酸（3 與 5 mM）。這些細(xì)胞中，谷氨酸可導(dǎo)致谷氨酰胺的消耗，從而促進(jìn)活性氧的生成，導(dǎo)致線粒體損傷與細(xì)胞死亡[2, 3]。谷氨酸處理后 8-10 小時(shí)期間，未檢測(cè)到 CI 值改變。其后 4-6 小時(shí)期間，CI 值快速降低。阻抗曲線圖反映出劑量依賴性的谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。阻抗測(cè)定后的E-Plate 96 反應(yīng)板 MTT 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了本研究結(jié)果（參見圖1C）。不同細(xì)胞接種密度與不同谷氨酸濃度下，細(xì)胞死亡的開始時(shí)間略有不同。如圖 1B，xCELLigence記錄阻抗圖在藥物給定時(shí)間點(diǎn)，對(duì)CI 值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。xCELLigence系統(tǒng)檢測(cè)到的谷氨酸誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡動(dòng)態(tài)變化，同前期研究中谷氨酸誘導(dǎo)HT-22 細(xì)胞死亡的時(shí)間段及特征具有良好的重復(fù)性，包括線粒體斷裂與細(xì)胞核 AIF 轉(zhuǎn)位[2, 3, 4]。

3.2 CELLigence系統(tǒng)神經(jīng)保護(hù)作用檢測(cè)
    為測(cè)定xCELLigence 系統(tǒng)是否可檢測(cè)神經(jīng)保護(hù)作用，我們使用預(yù)凋亡BH-3 蛋白BID的小分子抑制劑，即 BI-6C9，來防止谷氨酸對(duì) HT-22 細(xì)胞的毒性作用。如圖 2A 所示，在HT-22細(xì)胞預(yù)先添加 3 mM或5 mM的谷氨酸的情況下，BI-6C9可有效防止谷氨酸誘導(dǎo)的 HT-22 細(xì)胞的凋亡。儀器記錄的 BI-6C9 處理的細(xì)胞，無論是否添加谷氨酸，其CI 值均持續(xù)增加，表明BI-6C9 可維持細(xì)胞形態(tài)并延長(zhǎng)細(xì)胞生存時(shí)間。而且使用實(shí)驗(yàn)終止后的E-Plate 96 孔板，及在實(shí)驗(yàn)時(shí)平行設(shè)置的附加標(biāo)準(zhǔn) 96 孔板，進(jìn)行細(xì)胞增殖（MTT）實(shí)驗(yàn) ，均驗(yàn)證了BI-6C9-介導(dǎo)的保護(hù)作用（參見圖 2B）。這些結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了xCELLigence系統(tǒng)
    可用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞活性。通過光學(xué)顯微鏡觀察，將藥物對(duì) HT-22 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的作用進(jìn)行記錄（參見圖 2C）。添加谷氨酸后，細(xì)胞發(fā)生顯著形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞固縮并從培養(yǎng)板脫落，阻抗降低。通過 xCELLigence 系統(tǒng)相應(yīng) CI 值監(jiān)測(cè)記錄，進(jìn)一步證實(shí)了這種情況，監(jiān)測(cè)記錄表明，谷氨酸處理后，CI 值降低。然而在添加 BI-6C9 后，HT-22 細(xì)胞形態(tài)未改變，CI 值記錄進(jìn)一步證實(shí)了神經(jīng)保護(hù)的作用（參見圖 2A）。