無標(biāo)記活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)方面的應(yīng)用

 

神經(jīng)生物學(xué)是生物學(xué)中研究神經(jīng)系統(tǒng)的解剖、生理和病理方面內(nèi)容的一個(gè)分支。神經(jīng)科學(xué)尋求解釋神智活動(dòng)的生物學(xué)機(jī)制，即細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)機(jī)制。近年來神經(jīng)干細(xì)胞逐漸成為神經(jīng)生物學(xué)中的一大研究熱點(diǎn)。神經(jīng)干細(xì)胞是一群能自我修復(fù)和具有多種分化潛能的細(xì)胞，通過體外分離純化得到的小鼠或人源神經(jīng)干細(xì)胞，可以在特定條件下分化成為神經(jīng)元、星形膠質(zhì)和少突膠質(zhì)等細(xì)胞，從而成為再生醫(yī)學(xué)中極為理想的理論研究對(duì)象和臨床應(yīng)用來源。神經(jīng)干細(xì)胞的這種特性為神經(jīng)損傷和中樞神經(jīng)退行性疾病的治療提供了可能的途徑，并為損傷或病變的中樞神經(jīng)組織恢復(fù)相應(yīng)的功能這些人類多年來一直未能解決的治療難題提供了廣闊的思路和誘人的前景。

 

目前對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞在增殖、分化和凋亡過程中的機(jī)制研究，主要通過顯微鏡成像、芯片表達(dá)譜、免疫組化和電生理學(xué)這些傳統(tǒng)的“終點(diǎn)檢測法”來完成數(shù)據(jù)的獲取和分析，這種實(shí)驗(yàn)方法僅能在預(yù)先設(shè)定的有限時(shí)間點(diǎn)上采集數(shù)據(jù)，這樣由于無法觀察到整個(gè)實(shí)驗(yàn)進(jìn)程的變化，研究者很容易忽視一些重要的生物學(xué)事件。因此，如果采用活細(xì)胞動(dòng)態(tài)觀察來完整地記錄實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，不但避免了一些有意義的生物學(xué)事件的丟失，而且能了解到此事件是如何形成的（例如單個(gè)神經(jīng)干細(xì)胞從開始分裂、增殖并隨后分化直至最后凋亡的全過程），這種動(dòng)態(tài)的完整記錄對(duì)于科研工作者而言是非常直觀和具有啟發(fā)意義的。

 

此外，傳統(tǒng)的“終點(diǎn)檢測法”往往需要把細(xì)胞進(jìn)行各種生物素標(biāo)記或熒光染色，而這些標(biāo)記可能對(duì)細(xì)胞的生物學(xué)活動(dòng)有潛在的影響，因此檢測的指標(biāo)并不能真正反映細(xì)胞生理上的變化。如果有一種真正的無標(biāo)記檢測手段，使細(xì)胞在沒有任何外界干預(yù)而自然生長的情況下，對(duì)各種細(xì)胞形態(tài)變化的參數(shù)進(jìn)行分析，就能達(dá)到還原最真實(shí)的細(xì)胞行為變化的目的。CM Technologies公司的Cell-IQ無標(biāo)記活細(xì)胞分析平臺(tái)則為我們提供了這樣一種新的可能。

 

●  神經(jīng)干細(xì)胞的分化

●  神經(jīng)元突觸的測量

●  神經(jīng)干細(xì)胞（或神經(jīng)球）的增殖

●  神經(jīng)元/神經(jīng)元的遷移和運(yùn)動(dòng)能力的追蹤

●  神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育的譜系分析

 

 

Cell-IQ對(duì)于無標(biāo)記細(xì)胞相差圖像的分析原理就是基于其對(duì)細(xì)胞形態(tài)的識(shí)別。下圖是一張神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)過三天分化后的相差圖。這張圖片中的所有細(xì)胞從形態(tài)上大概可以分為以下四種類型：圖A的類神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞；圖B的類神經(jīng)元細(xì)胞；圖C的正處于增殖分裂的細(xì)胞；圖D的一些細(xì)胞碎片。Cell-IQ的軟件能對(duì)其中每種類型的典型細(xì)胞進(jìn)行識(shí)別、挑選和分門別類，并根據(jù)這樣一個(gè)分類細(xì)胞庫，自動(dòng)統(tǒng)計(jì)各類細(xì)胞的個(gè)數(shù)和比例，以生成一條隨時(shí)間變化的動(dòng)態(tài)曲線，以此研究在這段時(shí)間中，神經(jīng)干細(xì)胞的分化情況。

 

 

 

 

Cell-IQ可以對(duì)所分化的神經(jīng)元突觸長度和細(xì)胞個(gè)數(shù)進(jìn)行測量和計(jì)數(shù)，并對(duì)不同的處理組結(jié)果進(jìn)行比較。相比于傳統(tǒng)的需要將照片獲取后，然后進(jìn)行手工或者半自動(dòng)的測量實(shí)驗(yàn)操作方式而言， Cell-IQ軟件可以進(jìn)行批量化處理，極大地提高分析效率，花費(fèi)更少的時(shí)間和人力，而結(jié)果更加真實(shí)可靠。

 

左圖是一個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞（NG108-15）的分化實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)先用isoquercitrin（一種黃酮類化合物）處理NG108-15細(xì)胞后，再放入Cell-IQ中進(jìn)行4天的分化誘導(dǎo)和圖像采集。圖中紅點(diǎn)代表的是神經(jīng)細(xì)胞，藍(lán)線為軟件所識(shí)別的分化后的神經(jīng)元突觸。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在培養(yǎng)基-1的條件下，NG108-15細(xì)胞的分化更為顯著。

 

 

 

 

細(xì)胞追蹤是細(xì)胞學(xué)和生物學(xué)研究中重要的組成部分之一，在細(xì)胞行為、藥物和疾病中的研究至關(guān)重要，尤其對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的變化以及細(xì)胞相互作用的調(diào)控機(jī)制研究具有重要的意義。目前對(duì)一個(gè)目標(biāo)細(xì)胞或大量細(xì)胞進(jìn)行全面和準(zhǔn)確地追蹤，同時(shí)盡量避免其他細(xì)胞的干擾，是細(xì)胞追蹤的難點(diǎn)，也是近些年細(xì)胞追蹤的研究熱點(diǎn)。Cell-IQ強(qiáng)大的分析軟件可以對(duì)每個(gè)細(xì)胞的活動(dòng)軌跡進(jìn)行自動(dòng)或手動(dòng)追蹤和標(biāo)記，然后繪制出中心軌跡圖或者角度分析圖，并能給出每個(gè)細(xì)胞的移動(dòng)距離、位移、速度和方向等參數(shù)。

 

下圖為一個(gè)小鼠胚胎腦皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)追蹤分析實(shí)驗(yàn)。采集到圖像后，Cell-IQ軟件可以對(duì)視野中的每個(gè)細(xì)胞或者所有細(xì)胞進(jìn)行追蹤，并得到每個(gè)細(xì)胞最終的運(yùn)動(dòng)軌跡和方向圖，其余的如運(yùn)動(dòng)距離和速度等參數(shù)都能以Excel格式保存，方便隨時(shí)調(diào)用或用第三方軟件分析。

 

 

 

 

 

 

神經(jīng)干細(xì)胞可以通過對(duì)稱分裂的方式進(jìn)行增殖，或通過不對(duì)稱的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的其他各類細(xì)胞。其中，干細(xì)胞的譜系分析是研究神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育和分化機(jī)制的重要工具和手段。通過建立細(xì)胞譜系標(biāo)記技術(shù)來追蹤神經(jīng)干神經(jīng)的分裂和分化，從而得到細(xì)胞的譜系圖，在神經(jīng)干細(xì)胞分化調(diào)控機(jī)制的研究中具有重要意義。

 

下圖為小鼠胚胎腦皮層來源的神經(jīng)干細(xì)胞的分裂譜系分析實(shí)驗(yàn)。分析時(shí)，我們選取了視野中的三個(gè)細(xì)胞進(jìn)行增殖和分裂的追蹤，并詳細(xì)記錄了一個(gè)細(xì)胞如何從單個(gè)細(xì)胞分裂成兩個(gè)再到四個(gè)，最后停止增殖分裂的全過程。最后，Cell-IQ軟件能根據(jù)追蹤的結(jié)果，自動(dòng)得到每個(gè)細(xì)胞增殖分裂的譜系圖。

 

 

 

 

3D細(xì)胞培養(yǎng)旨在建立最貼近生理?xiàng)l件下的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，從而更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境。然而3D細(xì)胞樣品如神經(jīng)球成像一直以來是一個(gè)難題，許多傳統(tǒng)的顯微鏡無法同時(shí)對(duì)多個(gè)平面進(jìn)行聚焦從而保持整個(gè)球體細(xì)胞的圖像清晰。Cell-IQ的多層Z-stack掃描成像技術(shù)配合智能追焦功能，可以跟蹤細(xì)胞樣品在Z軸的高度變化而自動(dòng)調(diào)整最佳的聚焦平面，從而確�；罴�(xì)胞在長時(shí)間的生長、運(yùn)動(dòng)過程中總處于聚焦范圍內(nèi)，因此可以對(duì)3D細(xì)胞樣品如神經(jīng)球和胚胎等進(jìn)行成像和分析。

 

 

上圖為球體細(xì)胞（spheroid）的增殖實(shí)驗(yàn)，在加入抑制劑后，球體細(xì)胞向外遷移和增殖的能力得到了顯著的抑制。Cell-IQ的軟件能夠分別對(duì)綠色的球體本體和紅色的遷移細(xì)胞進(jìn)行面積的計(jì)算，從而實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地定量給藥前后球體細(xì)胞向外遷移增殖的情況。

 

 

上圖為懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)球增殖實(shí)驗(yàn)。通過降低載物臺(tái)的移動(dòng)速度和加速度，減少震動(dòng)對(duì)體系的影響，懸浮細(xì)胞同樣能進(jìn)行成像和分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，給藥處理后顯著抑制了神經(jīng)球的增殖。

 

除了在相差圖片上的無標(biāo)記分析外，Cell-IQ還提供了3種熒光通道，多達(dá)30多種熒光濾片的選擇，可以滿足絕大多數(shù)熒光染色的需求。因此，一方面我們可以對(duì)已經(jīng)標(biāo)記熒光的細(xì)胞同時(shí)進(jìn)行相差圖片和熒光圖片的采集、合并和分析；或者在完成相差圖片的采集后，再將細(xì)胞固定后進(jìn)行傳統(tǒng)的免疫熒光染色以進(jìn)一步驗(yàn)證無標(biāo)記的分析結(jié)果。

 

下圖為神經(jīng)干細(xì)胞的分化實(shí)驗(yàn)。圖A為相差圖片，圖B為神經(jīng)元marker βIII-tubulin的染色結(jié)果。在圖A和B中，紅色箭頭所指的神經(jīng)元突觸表明相差圖片和熒光染色的結(jié)果是相互匹配的。圖C的白色短箭頭代表的是類神經(jīng)元細(xì)胞，同樣在圖D的染色中得到了證實(shí)（紅色）；而圖C的白色長箭頭在形態(tài)上類似于膠質(zhì)細(xì)胞，而這個(gè)結(jié)果也與圖D膠質(zhì)細(xì)胞的 marker vimentin染色（綠色）結(jié)果相一致。

 

 

 

結(jié)束語：以上是無標(biāo)記活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析技術(shù)在神經(jīng)生物學(xué)方面的應(yīng)用。其中不難看出，無標(biāo)記分析技術(shù)的原理是基于在相差圖片的基礎(chǔ)上，通過對(duì)細(xì)胞形態(tài)的識(shí)別和分辨來對(duì)細(xì)胞行為變化的各種參數(shù)進(jìn)行實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)地定量分析。因此，無標(biāo)記活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析技術(shù)旨在杜絕一切外界因素（如生物素標(biāo)記和熒光染色）干擾的情況下，盡可能地讓細(xì)胞自然地生長從而還原細(xì)胞最天然的生理狀態(tài)，通過在這種“原生態(tài)”的細(xì)胞上動(dòng)態(tài)觀察和實(shí)時(shí)定量細(xì)胞形態(tài)、行為的變化，力求記錄一個(gè)最真實(shí)的生物學(xué)事情的發(fā)生和演變！

平臺(tái)簡介：Cell IQ是芬蘭CM Technologies公司生產(chǎn)的一個(gè)集培養(yǎng)管理、觀察記錄和分析于一身的一體式無標(biāo)記活細(xì)胞動(dòng)態(tài)分析系統(tǒng)。其通過專利細(xì)胞封蓋系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)精密的微小培養(yǎng)室體系，從而保證細(xì)胞在最優(yōu)的生長環(huán)境下維持一個(gè)健康穩(wěn)定的狀態(tài)以進(jìn)行長期的培養(yǎng)觀察和記錄。內(nèi)置的成像系統(tǒng)和專業(yè)高靈敏的數(shù)碼CCD相機(jī)，再配合獨(dú)特的全聚焦和智能追焦技術(shù)，可確�；罴�(xì)胞在長時(shí)間的生長和運(yùn)動(dòng)過程中總處在聚焦范圍內(nèi)，以此獲得高質(zhì)量的細(xì)胞相差圖片，因此可以對(duì)3D細(xì)胞樣品如神經(jīng)球和胚胎等進(jìn)行成像和分析。最后，Cell-IQ強(qiáng)大且創(chuàng)新的的分析軟件可在完全無標(biāo)記的“原生態(tài)”細(xì)胞相差圖像上，通過對(duì)其形態(tài)的分辨與識(shí)別來進(jìn)行不同細(xì)胞種群、周期和時(shí)期的區(qū)分劃類從而完成各種復(fù)雜的無標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。