Western常見問題分析（二）

做Western來講，理論上單抗比多抗的特異性要好，但單抗種類較少，一般價(jià)格偏高，所以一般來說多抗足夠了。用于Western的抗體和用于ELISA的抗體，一般來說用于Western的抗體識(shí)別的是氨基酸序列特異性，而可用于ELISA的抗體要看抗原種類，有些是識(shí)別氨基酸序列特異性，有些是識(shí)別構(gòu)象特異性，所以一般根據(jù)說明書來確定。做免疫印跡選擇抗體主要考慮兩個(gè)問題，一時(shí)所選抗體是否識(shí)別凝膠電泳后轉(zhuǎn)印至膜上的變性蛋白，另一個(gè)是所選抗體是否會(huì)引起交叉反應(yīng)條帶。

可以相等，但是如果紙、膜比凝膠大就比較容易形成短路了，上下兩層濾紙也不能因過大而相互接觸，這樣會(huì)短路，電流不會(huì)通過膠和濾紙。轉(zhuǎn)移前和轉(zhuǎn)移過程中看看電壓就行，正常的半干轉(zhuǎn)是慢慢變高的，最后結(jié)束時(shí)一般是開始的1.5-3倍都是正常的。

陰離子染料是較常用的，特別是氨基黑，脫色快，背景低檢測極限可達(dá)1.5ug，考馬斯亮藍(lán)雖然與氨基黑有相同的靈敏度，但脫色慢，背景高。麗春紅S和快綠在檢測后容易從蛋白質(zhì)中除去，以便進(jìn)行隨后的氨基酸分析。
膠體金，靈敏度高，檢測范圍可達(dá)到pg級，但染色穩(wěn)定。
生物素話靈敏度位于1.2之間，可用于任何一種膜。

可以考慮，轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇，因?yàn)榧状伎梢越档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率，但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時(shí)間；轉(zhuǎn)移緩沖液中加入終濃度0.1% SDS，也是為了增加轉(zhuǎn)移效率；用優(yōu)質(zhì)的轉(zhuǎn)移膜，或使用小孔徑的NC膜，低濃度膠，提高轉(zhuǎn)移電壓/電流，增加轉(zhuǎn)移時(shí)間。

DAB顯色在辣根過氧化物酶的作用能形成一種灰褐色的終末產(chǎn)物，該產(chǎn)物難溶于醇和其他有機(jī)溶劑，DAB的氧化還能引起聚合作用，導(dǎo)致與四氧化鋨反應(yīng)而增加其染色強(qiáng)度和電子密度。