多色流式細(xì)胞術(shù)該進(jìn)行配色的方法與技巧介紹
瀏覽次數(shù):129 發(fā)布日期:2024-11-12
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流式細(xì)胞術(shù)是一種利用流式細(xì)胞儀對(duì)快速流動(dòng)的細(xì)胞或顆粒進(jìn)行多參數(shù)分析的技術(shù),能夠?qū)?xì)胞表面和內(nèi)部的蛋白質(zhì)、DNA、RNA等進(jìn)行定量檢測(cè)和分類,同時(shí)可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的分選。
流式抗體(FACS Antibody)是專為流式細(xì)胞術(shù)設(shè)計(jì)的抗體,用于檢測(cè)和分析細(xì)胞表面或內(nèi)部的特定蛋白質(zhì)。這些抗體通常帶有熒光標(biāo)記,流式細(xì)胞儀通過(guò)檢測(cè)其發(fā)出的熒光信號(hào)來(lái)識(shí)別并分析細(xì)胞特征(如圖1)。流式細(xì)胞術(shù)可使用直接標(biāo)記(如FITC、PE、APC等)的抗體進(jìn)行檢測(cè),或通過(guò)未標(biāo)記抗體進(jìn)行間接檢測(cè)。
▲圖1:流式抗體的工作原理示意圖
流式抗體的特點(diǎn):
1)熒光標(biāo)記:流式抗體通常結(jié)合熒光染料,如FITC、PE、APC 等,便于在流式細(xì)胞儀中檢測(cè)目標(biāo)抗原的表達(dá)水平。
2)高特異性和親和力:抗體需對(duì)目標(biāo)抗原高度特異,以確保流式檢測(cè)中的精確性。
3)低非特異性結(jié)合:流式抗體通常經(jīng)過(guò)優(yōu)化,以減少非特異性結(jié)合,提高信噪比。
4)穩(wěn)定性:流式抗體的熒光標(biāo)記物應(yīng)在實(shí)驗(yàn)條件下具有較高的穩(wěn)定性,以保證信號(hào)不受環(huán)境光和樣品處理的影響。
流式抗體的類型:
1)單克隆抗體:針對(duì)單一抗原表位,提供一致性高、特異性強(qiáng)的信號(hào),是流式細(xì)胞術(shù)中的首選。
2)多克隆抗體:識(shí)別抗原的多個(gè)表位,信號(hào)強(qiáng)度較高,但特異性較單克隆抗體低,通常在特定應(yīng)用中使用。
3)直接標(biāo)記抗體:抗體直接結(jié)合熒光染料,用于單一染色,便于操作,信噪比較高。
4)間接標(biāo)記抗體:使用未標(biāo)記的抗體加上熒光標(biāo)記的二抗,用于增加信號(hào)強(qiáng)度或在稀有抗體不足的情況下應(yīng)用。
5)異型對(duì)照抗體:用作陰性對(duì)照,以確保信號(hào)特異性,排除非特異性結(jié)合的影響。
流式抗體的選擇:
1)抗體的特異性和親和力:根據(jù)目標(biāo)抗原,選擇已驗(yàn)證具有良好特異性和親和力的抗體,以確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性。
2)熒光染料的選擇:根據(jù)多重染色實(shí)驗(yàn)的要求選擇不同光譜的熒光染料,避免光譜重疊并優(yōu)化信號(hào)檢測(cè)。
3)抗體來(lái)源:選擇與實(shí)驗(yàn)物種匹配的抗體來(lái)源,以減少交叉反應(yīng)。
4)直接或間接標(biāo)記:對(duì)于高表達(dá)抗原,直接標(biāo)記抗體更簡(jiǎn)便;對(duì)于低表達(dá)抗原,間接標(biāo)記抗體可提高信號(hào)。
5)適當(dāng)?shù)膶?duì)照:包括異型對(duì)照、未染色對(duì)照、單染色對(duì)照等,以校正信號(hào)背景和優(yōu)化數(shù)據(jù)分析。
6)選擇合適的流式抗體能夠顯著提高實(shí)驗(yàn)的特異性、信噪比和數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性。
多色流式細(xì)胞術(shù)該如何進(jìn)行配色?
流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表面上是一個(gè)非常簡(jiǎn)單的試驗(yàn),但是對(duì)于大多數(shù)新手來(lái)說(shuō),除了要慎重選擇抗體之外,還要熟悉如何進(jìn)行熒光配色,最大限度地減少對(duì)補(bǔ)償和重疊的調(diào)整,這也是流式實(shí)驗(yàn)的重中之重。
大部分科研工作者對(duì)流式的應(yīng)用還局限于四色以內(nèi)分析,對(duì)于多色(6色以上)分析往往掌握不好,究其原因是染料搭配不合適,導(dǎo)致各染料之間干擾很大,結(jié)果很難分析。本文總結(jié)了流式多色染色熒光搭配的幾點(diǎn)技巧以供參考:
技巧1:選擇合適的目標(biāo) Marker并確定Marker 的表達(dá)位置
通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn),在試驗(yàn)之前需要確定好Marker以及Marker 之間的邏輯關(guān)系(圈門的父子關(guān)系,比如 T 細(xì)胞CD3 是「父」,而 CD4 或者 CD8 就是子」)。
對(duì)于細(xì)胞質(zhì)或者細(xì)胞核的 Marker,需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定破膜/破核膜。在做胞質(zhì)或胞核 Marker 染色實(shí)驗(yàn)操作時(shí),需要先染細(xì)胞表面 Marker,再對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定破膜,最后對(duì)胞內(nèi)或核內(nèi) Marker 染色。
一般來(lái)說(shuō),絕大部分 CD 分子指標(biāo),都是細(xì)胞表面指標(biāo);IL 白介系列、IFN-γ、TNF-α 等,屬于胞內(nèi)指標(biāo);而最常見(jiàn)的核內(nèi)染色指標(biāo)是 Foxp3(如表)
技巧2:選擇流式細(xì)胞儀能檢測(cè)的染料
要充分了解流式細(xì)胞儀有哪些激光器,有哪些濾光片通道,充分利用儀器允許的全部熒光染料,盡量選用多激光激發(fā)。
如圖2列出了流式細(xì)胞儀的激發(fā)器和每個(gè)激發(fā)器對(duì)應(yīng)能檢測(cè)的染料[1]。下圖只是列出了每個(gè)激發(fā)器可能激發(fā)的染料,并未列出所有染料,并不是儀器配置了該激發(fā)器就一定能激發(fā)出對(duì)應(yīng)的染料,還需要根據(jù)儀器的通道配置來(lái)選擇,即每個(gè)激發(fā)器對(duì)應(yīng)有哪些檢測(cè)通道,而每個(gè)檢測(cè)通道只能對(duì)應(yīng)檢測(cè)一種染料,但不同染料可能是由同一個(gè)檢測(cè)通道來(lái)檢測(cè),那么這些染料我們稱之為熒光對(duì)等染料,熒光對(duì)等染料是不能共用的。
▲圖2:不同激發(fā)器可激發(fā)的熒光染料
技巧3.強(qiáng)弱互補(bǔ)
熒光染料亮度有強(qiáng)弱之分,抗原表達(dá)有高低區(qū)別,因此弱表達(dá)抗原應(yīng)該選擇強(qiáng)熒光染料,強(qiáng)表達(dá)抗原選擇弱熒光染料,使染料的亮度與抗原密度匹配。通常,根據(jù)待測(cè)細(xì)胞類型中,相應(yīng)抗原的表達(dá)量,可以粗略地將抗原分子分為三類[2]:
1)很容易鑒定、容易區(qū)分陰陽(yáng)性細(xì)胞群、陰陽(yáng)性峰明顯分開(kāi)的抗原。例如:CD3,CD4,CD19 等。
2)很容易鑒定、較高水平表達(dá)、經(jīng)常連續(xù)性表達(dá)。例如:CD27,CD28,CD45RA, CD45RO 等。
3)低水平表達(dá)、激活性 Marker、未知但關(guān)鍵。例如:CD25,STAT5,F(xiàn)oxp3 等。
同樣,弱表達(dá)抗原放在被干擾較小的檢測(cè)通道,而強(qiáng)表達(dá)抗原放在對(duì)其他通道干擾較小的檢測(cè)通道,比如FITC\ PE\ PE-Cy7\ APC這四色一起檢測(cè)時(shí),弱表達(dá)抗原應(yīng)該搭配APC熒光染料標(biāo)記的抗體;強(qiáng)表達(dá)的抗原最終染色的信號(hào)較強(qiáng),容易對(duì)其他檢測(cè)通道造成干擾,因此我們應(yīng)該選擇對(duì)其他通道干擾較小的熒光染料。
因抗原表達(dá)密度受細(xì)胞類型以及細(xì)胞活化程度的影響,所以在此無(wú)法詳細(xì)列出各抗原的表達(dá)密度強(qiáng)弱。但熒光染料的強(qiáng)弱是固定的,熒光的強(qiáng)度與染色指數(shù)(Stain Index)有關(guān),一般染色指數(shù)越高,熒光強(qiáng)度越好;染色指數(shù)較低,染色強(qiáng)度相對(duì)較差,通過(guò)染色指數(shù)可以直接比較出各個(gè)熒光染料的強(qiáng)度(如圖3)。
▲圖3:不同類型熒光染料的染色指數(shù)排行[3]
技巧4:表達(dá)互相排斥的抗原可以放在相互干擾較大的檢測(cè)通道,共表達(dá)的抗原避免放在相互干擾的通道
表達(dá)相互排斥的抗原指的是兩種抗原不會(huì)同時(shí)表達(dá)在一種細(xì)胞上,這兩種抗原表達(dá)在兩種細(xì)胞上(例如CD4和CD8),因此流式圖上分群很明顯,即使熒光染料之間干擾很大,也很容易通過(guò)補(bǔ)償?shù)恼{(diào)節(jié)避免干擾;
而共表達(dá)的抗原指的是這兩種抗原表達(dá)在同一種細(xì)胞上(例如CD4和CD25),在流式圖上我們是要分析雙陽(yáng)性的細(xì)胞比例,因此如果這兩個(gè)抗體對(duì)應(yīng)的熒光染料之間有干擾,則會(huì)對(duì)圈門結(jié)果造成干擾,影響分析的細(xì)胞比例。
當(dāng)然,選擇優(yōu)質(zhì)的特異性抗體是實(shí)驗(yàn)成功的根本保證。在設(shè)計(jì)多色流式 panel 時(shí),重要的是要了解儀器的配置,以及如何最佳地組合多種熒光染料,以最大程度地減少光譜重疊、提高結(jié)果的準(zhǔn)確性。
TargetMol 可為您提供多種靶點(diǎn)的流式抗體,可用于流式細(xì)胞熒光分選技術(shù)(FACS)、 ELISA、免疫印跡試驗(yàn)(Western Blot, WB)和免疫熒光(Immunofluorescence, IF)等多種實(shí)驗(yàn)。
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TargetMol流式抗體產(chǎn)品優(yōu)勢(shì)
哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng):
我們的抗原使用哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng),能最大限度保留人源蛋白天然結(jié)構(gòu)、功能以及翻譯后修飾。
兔源單克隆重組抗體:
我們的抗體使用兔子為免疫載體,兔子具有成熟的免疫機(jī)制并且與人同源性低。兔源抗體具有親和力強(qiáng)、靈敏度高、特異性強(qiáng)、多樣性豐富等特點(diǎn)。此外,重組抗體的制備批次間差異小。
高穩(wěn)定性:
產(chǎn)品均通過(guò)凍融穩(wěn)定性和加速穩(wěn)定性測(cè)試,具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。
高覆蓋度、多表位、多標(biāo)記:
針對(duì)370+種人源蛋白兔單抗,每種抗原可提供多個(gè)潛在不同表位的抗體,系列抗體可以間接標(biāo)記多種熒光蛋白(APC、PE等)或熒光小分子(AF488、AF555、AF647等)。
產(chǎn)品驗(yàn)證數(shù)據(jù):
Flow cytometry on MV4-11 using anti CD47 (red) rabbit mAb and goat anti-rabbit IgG (H+L), BV405,control cells were stained only with BV405 (Blue)
參考資料:
[1]Cossarizza A, et,al. Guidelines for the use of flow cytometry and cell sorting in immunological studies (second edition). Eur J Immunol. 2019 Oct;49(10):1457-1973.
[2]Flores-Montero J,et,al. Fluorochrome choices for multi-color flow cytometry. J Immunol Methods. 2019 Dec;475:112618.
[3]Mair F,et,al. High-Dimensional Immunophenotyping with Fluorescence-Based Cytometry: A Practical Guidebook. Methods Mol Biol. 2019;2032:1-29.