CIK/DC-CIK及其在細胞治療上的應(yīng)用
【背景知識】
CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的縮寫，中文全稱為“細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞”。
CIK是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)細胞群，其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。
CIK細胞優(yōu)勢：殺瘤活性高、殺瘤譜廣，對正常組織毒性低，體外可高度擴增，是目前臨床上廣泛使用的過繼性免疫治療細胞。
【培養(yǎng)原理】
CIK培養(yǎng)用細胞因子和抗體：
1. CD3激發(fā)型單抗：
T細胞活化的第一信號來自于T細胞表面的受體，即T細胞抗原受體(T cell antigen receptor, TCR)與APC提呈的抗原的特異性結(jié)合，也就是T細胞對抗原的特異性識別。TCR是由2條不同肽鏈構(gòu)成的異二聚體，在T細胞表面，其與CD3分子通過非共價鍵結(jié)合，形成 TCR/CD3復(fù)合體。TCR識別特異性抗原后會引起CD3和T細胞表面的輔助受體CD4或 CD8分子的胞漿尾部聚集，進而激活與胞漿尾部相連的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)進一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，從而引起激酶活化的級聯(lián)反應(yīng)(磷脂酰肌醇途徑或 MAP激酶途徑等)，最終通過激活轉(zhuǎn)錄因子，使其進入細胞核內(nèi)，結(jié)合于調(diào)控T細胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-γ等)，引起基因的表達和轉(zhuǎn)錄，T細胞因而由靜止狀態(tài)轉(zhuǎn)為增殖和活化狀態(tài)。
由上可見，CD3分子在T細胞活化信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著極其關(guān)鍵的作用。CD3激發(fā)型單抗與T細胞表面CD3分子特異性結(jié)合后，可引起CD3分子胞漿區(qū)ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，進而導(dǎo)致 T細胞增殖和活化的下游信號的激活，從而使T細胞增殖和活化。也就是說，CD3激發(fā)型單抗能夠模擬抗原與TCR/CD3復(fù)合物的識別和激活過程，從而引起 T細胞的增殖與活化，因此是CIK細胞培養(yǎng)中不可或缺的刺激因素。
此外，CD3激發(fā)型單抗在選用時一定要注意克隆號。研究表明，僅克隆號為OKT-3的 CD3激發(fā)型單抗可以刺激所有人的T細胞的增殖，而其它克隆號的CD3激發(fā)型單抗僅能刺激一部分人的 T細胞。因此，在進行CIK培養(yǎng)時，最好選用OKT-3克隆，以保證每個患者的 T細胞均能被激活。
2. IL-2 (白細胞介素-2)
IL-2最初發(fā)現(xiàn)時被稱為T細胞生長因子(T cell growth factor, TCGF)，是引起T細胞增殖最重要的細胞因子。IL-2既是自分泌細胞因子，也是旁分泌細胞因子，其通過與T細胞表面的IL-2受體(IL-2R)的特異性結(jié)合而促使T細胞活化，并進入細胞分裂狀態(tài)。
此外，IL-2還可刺激NK細胞的生長并增強其殺傷能力。因此CIK細胞培養(yǎng)中須添加IL-2，以促進T細胞的增殖與活化。
3. IFN-γ(干擾素-γ)
IFN-γ具有上調(diào)外周血淋巴細胞表面IL-2R表達的作用，因此會增強T細胞對IL-2促增殖反應(yīng)的敏感度和強度。在誘導(dǎo)CIK細胞形成的過程中加入IFN-γ，可降低IL-2的用量。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ加入的順序與CIK的細胞毒活性密切相關(guān)。先加入IFN-γ，培養(yǎng)24后再加入IL-2，可明顯提高CIK的細胞毒活性。
4. IL-1α(白細胞介素-1α)
IL-1α也可以介導(dǎo)外周血淋巴細胞表面上調(diào)表達IL-2R。當IL-1α與IFN-γ和激發(fā)型CD3單抗合用時，可以明顯提高CIK的細胞毒作用。
【細胞制備】
1．外周血單個核細胞的采集
1.1 用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞50-100mL；
1.2 淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
1.3 無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的PBMC。
2．CIK細胞的培養(yǎng)及鑒定
2.1 將PBMC按1-2x 106/ml的濃度懸浮于無血清培養(yǎng)液中，加入1,000 U/ml的重組人IFN-γ，37oC，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
2.2 24h后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和300 U/ml的重組人IL-2，刺激CIK細胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1α。
2.3每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
2.4在培養(yǎng)的第14d，收獲CIK細胞。
2.5 CIK細胞質(zhì)控：
2.5.1 臺盼藍染色檢測：活細胞應(yīng)在80%以上；
2.5.2 流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3+CD56+細胞的比例應(yīng)在20%以上。
2.5.3 細胞殺傷實驗：以CIK細胞為效應(yīng)細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為靶細胞，將效應(yīng)細胞與靶細胞按10:1(數(shù)目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶細胞1 x 104個，終體積為200μl，設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒檢測效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷率。
2.5.4收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標準：病原學(xué)檢測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。
【步驟簡圖】
生產(chǎn)商 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品規(guī)格 使用濃度
eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg
PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg
PeproTech 重組人IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml
PeproTech 重組人IL-1α (Animal Free) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重組人IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml
【推薦試劑】
生產(chǎn)商 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品規(guī)格
PeproTech 重組人Flt-3 Ligand (Animal Free) AF-300-19 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人IL-7 (Animal Free) AF-200-07 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人IL-15 (Animal Free) AF-200-15 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人SCF (Animal Free) AF-300-07 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg
注：Animal Free意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產(chǎn)過程中不會有任何動物源性物質(zhì)，尤其是牛蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細胞治療的體外細胞培養(yǎng)過程中最好使用無動物成分的重組細胞因子。
【參考文獻】
[1] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133 
【背景知識】
DC是“Dendritic Cells”的縮寫，中文全稱為“樹突狀細胞”，因其成熟時伸出許多樹突樣或偽足樣突起而得名。DC是由2011年諾貝爾獎獲得者、加拿大籍科學(xué)家Ralph M. Steinman于1973年發(fā)現(xiàn)的，是目前發(fā)現(xiàn)的功能最強的抗原遞呈細胞(Antigen Presenting Cells, APC)。已證實，DC是唯一能夠顯著刺激初始T細胞(Naïve T cells)增殖的APC，成熟的DC可以通過Ⅱ型組織相容性抗原（MHC-Ⅱ）等途徑提呈腫瘤抗原，有效抵制腫瘤細胞的免疫逃逸機制，而其它APC(如單核巨噬細胞，B細胞等)僅能刺激已活化的或記憶性的T細胞。DC是機體適應(yīng)性T細胞免疫應(yīng)答的始動者，在腫瘤免疫中具有極其重要的作用。
CIK是單個核細胞在CD3單抗和多種細胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培養(yǎng)獲得的一群以CD3+CD56+細胞為主要效應(yīng)細胞的異質(zhì)細胞群，其既具有T淋巴細胞強大的抗腫瘤活性，又具有NK細胞(自然殺傷細胞)的非MHC(主要組織相容性抗原)限制性腫瘤殺傷能力。
DC-CIK (或DC+CIK)[1]是指與DC細胞共培養(yǎng)的CIK細胞，也可以說，最終的效應(yīng)細胞是經(jīng)DC體外活化的CIK細胞。多項研究表明，DC與CIK具有協(xié)同作用，共同孵育后，DC表面共刺激分子的表達及抗原遞呈能力均明顯提高，而CIK的增殖能力和體內(nèi)外細胞毒活性也得以增強，因此DC-CIK較單獨的CIK治療更為有效。若將腫瘤抗原負載的DC與CIK共培養(yǎng)，可刺激產(chǎn)生腫瘤抗原特異性的T細胞，這樣的DC-CIK治療則兼具特異性和非特異性雙重腫瘤殺傷作用，比未負載腫瘤抗原的DC刺激活化的CIK活性更強，常被用于臨床和科研。
CIK細胞和DC細胞是細胞免疫治療的2個重要組成部分，兩者聯(lián)合可確保高效的免疫反應(yīng)。
【培養(yǎng)原理】
1．DC培養(yǎng)用細胞因子：
1.1 GM-CSF(粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子)
GM-CSF是一種造血生長因子，在體外可刺激中性粒細胞和巨噬細胞的集落形成，并具有促進早期紅巨核細胞、嗜酸性祖細胞增殖和發(fā)育的功能。
GM-CSF是最早被鑒定出來對于DC有作用的細胞因子之一。GM-CSF在DC培養(yǎng)中的功能是促進單核細胞向大巨噬樣細胞分化，細胞表面MHC II類分子的表達得以提高，從而增強細胞的抗原遞呈功能。此外，GM-CSF還可促進DC的存活。
1.2 IL-4 (白細胞介素-4)
IL-4在由單核細胞誘導(dǎo)成DC的過程中發(fā)揮的作用是抑制巨噬細胞的過度生長，從而引導(dǎo)單核細胞向DC方向分化。若培養(yǎng)體系中不加IL-4，單核細胞將分化為巨噬細胞。同時，IL-4還有降低細胞表面表達CD14分子的能力。CD14表達水平的降低是單核細胞分化為DC的重要標志。
GM-CSF和IL-4共同作用可使單核細胞定向分化為未成熟DC(immature DC)，此時的DC具有較強的抗原攝取和加工能力，但抗原遞呈能力很弱。細胞表面中度表達MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)，但不表達CD14。
1.3 TNF-α (腫瘤壞死因子-α)
TNF-α可下調(diào)未成熟DC的巨胞飲作用和表面Fc受體的表達，使細胞內(nèi)MHC II類分子區(qū)室(class II compartment)消失，但能夠上調(diào)細胞表面 MHC I類、II類分子和B7家族分子(CD80, CD86等)的表達，使未成熟DC分化為成熟DC(mature DC)，此時DC的抗原攝取和加工能力明顯減弱，而抗原遞呈能力顯著增強，可極強的激活T細胞。
2. CIK培養(yǎng)用細胞因子和抗體（同上）
【細胞制備】
1．外周血單個核細胞的采集
1.1用血細胞分離機采集患者自身的外周血單個核細胞80-100mL；
1.2淋巴細胞分離液密度梯度離心法進一步純化單個核細胞(PBMC)；
1.3無血清培養(yǎng)液洗滌2次，獲得純度在90%以上的 PBMC，細胞數(shù)量需達到1-3x108。
2．(可選步驟) 腫瘤抗原的制備
用于負載 DC的腫瘤抗原可以是腫瘤特異性抗原肽(Tumor-Specific Antigens, TSA)或腫瘤相關(guān)抗原(Tumor-Associated Antigens, TAA)，也可以是腫瘤全細胞抗原。
用TSA或 TAA負載的DC具有很好的靶向性，但該方法具有已確定的腫瘤特異性抗原或抗原肽種類少和單一抗原的免疫攻擊經(jīng)常無法殺傷腫瘤細胞等缺陷。而用腫瘤全細胞抗原負載DC可克服這些缺陷，因為此時無需知道那些抗原是腫瘤細胞的TSA或TAA，而且全抗原中的多種不同腫瘤抗原沖擊DC可誘導(dǎo)產(chǎn)生針對不同抗原決定簇的細胞毒T淋巴細胞(CTL)克隆，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞的有效殺傷。
腫瘤細胞全抗原負載DC的方法很多，包括用腫瘤細胞裂解液負載DC、用凋亡腫瘤細胞負載DC、用壞死或死亡的腫瘤細胞負載DC，用腫瘤活細胞負載DC，和將腫瘤細胞與DC融合等。目前臨床上常用的是用腫瘤細胞裂解液負載DC，因該方法簡單、快速、有效。
反復(fù)凍融是獲得腫瘤細胞裂解液的常見方法，具體步驟如下：
2.1手術(shù)切除腫瘤標本，無菌條件下，將壞死組織和癌旁非腫瘤組織去除干凈；
2.2無菌生理鹽水洗3次；
2.3用無菌的組織剪將腫瘤組織剪碎，加入RPMI 1640培養(yǎng)基，充分研磨；
2.4 200目無菌網(wǎng)過濾后收集單細胞懸液；
2.5用RPMI 1640培養(yǎng)基重懸細胞至1-2 x 107/ml，裝入5ml無菌凍存管中；
2.6將凍存管浸入液氮中速凍，10 min后取出，再迅速放入37oC水浴中解凍10 min。
反復(fù) 3-5 次；
注：也可以-80℃/37℃ 反復(fù)凍融3-5次。
2.7將腫瘤裂解物加入離心管中，3000rpm，離心10min；
2.8收取上清，0.22μm 濾膜過濾除菌，留樣檢測蛋白含量及細菌、真菌和支原體；
2.9 -80oC保存?zhèn)溆谩?
3. CIK 細胞的培養(yǎng)及鑒定
3.1 步驟1中獲得的PBMC用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至2 x 106/ml，置于培養(yǎng)瓶內(nèi)；
3.2 37℃，5%CO2 培養(yǎng)箱中孵育2h，以使單核細胞貼壁；
3.3 收集懸浮細胞，用無血清培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至 1-2 x 106/ml；
3.4 加入1,000 U/ml 的重組人IFN-γ培養(yǎng)；
3.5 24h 后加入50ng/ml的CD3單克隆抗體和300 U/ml的重組人IL-2，刺激CIK細胞的生長和增殖；
注：此時也可同時加入100 U/ml的重組人IL-1。
3.6 每3天半量換液或擴瓶一次，并補加重組人IL-2 300 U/ml；
3.7 在培養(yǎng)的第7d，收獲CIK細胞，此時數(shù)量應(yīng)達到1x109個以上。
3.8 CIK細胞質(zhì)控：
3.8.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應(yīng)在80%以上；
3.8.2 用流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8和CD56等分子的表達，觀察CD3+CD56+細胞的比例是否明顯提高。
4．DC 細胞的培養(yǎng)及鑒定
4.1 步驟3.2中剩下的貼壁細胞(主要是 CD14+的單核細胞)，加入含重組人GM-CSF 500-1,000U/ml和重組人IL-4 500U/ml的無血清培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，誘導(dǎo)單核細胞向DC細胞分化；
4.2 每3d半量換液一次，并補足細胞因子；
4.3 (可選步驟) 在培養(yǎng)的第5d，加入步驟2中獲得的腫瘤抗原50μg/ml，對DC進行抗原負載；
注：若不對DC進行抗原負載，該步省略。
4.4在培養(yǎng)的第6d，加入重組人TNF-γ(500U/ml)，誘導(dǎo)DC細胞成熟；
4.5在培養(yǎng)的第7d或第8d，收獲DC細胞，其數(shù)量應(yīng)達到1×106個以上；
4.6 DC的質(zhì)檢：
4.6.1 臺盼藍染色檢測細胞活力：活細胞應(yīng)在80%以上；
4.6.2 流式細胞儀檢測DC細胞表面HLA-DR、CD83和CD86等分子的表達，以確定DC 是否成熟。
5. DC-CIK 細胞的制備和質(zhì)檢
5.1 收集步驟4和步驟3中所獲得的DC細胞和CIK細胞，按1:10 (數(shù)目比)的比例共培養(yǎng)，無血清培養(yǎng)液中添加重組人IL-2 (300 U/ml)；
5.2 每3天半量換液一次，并補加重組人IL-2 (300U/ml)；
5.3 在第7d收集細胞，細胞數(shù)量應(yīng)達到1×1010個以上；
5.4 DC-CIK細胞的質(zhì)檢：
5.4.1 臺盼藍染色檢測：活細胞應(yīng)在80%以上；
5.4.2 流式細胞儀檢測細胞表面CD3、CD8、CD56等分子的表達：CD3+CD56+細胞的比例應(yīng)在20%以上。
5.4.3 細胞殺傷實驗：以DC-CIK細胞為效應(yīng)細胞，以腫瘤細胞(可為原代腫瘤細胞或腫瘤細胞株)為靶細胞，將效應(yīng)細胞與靶細胞按10:1(數(shù)目比)的比例加入96孔U型板中，每孔含靶細胞1x104個，終體積為200μl，設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)4h，然后取培養(yǎng)上清，用乳酸脫氫酶(LDH) 試劑盒檢測效應(yīng)細胞對靶細胞的殺傷率。
5.4.4收獲細胞前，取少量培養(yǎng)物進行細菌、真菌培養(yǎng)，并檢測支原體、衣原體，及內(nèi)毒素(標準：病原學(xué)檢測陰性，內(nèi)毒素<5 Eu)。
【步驟簡圖】
【推薦試劑】
生產(chǎn)商 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品規(guī)格 使用濃度
eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg
PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg
PeproTech 重組人 GM-CSF (Animal Free) AF-300-03 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 50-100ng/ml
PeproTech 重組人 IFN-γ (Animal Free) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml
PeproTech 重組人 IL-1α (Animal Free) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重組人 IL-2 (Animal Free) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml
PeproTech 重組人 IL-4 (Animal Free) AF-200-04 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 100ng/ml
注：Animal Free 意為無動物成分。無動物成分的重組細胞因子在生產(chǎn)過程中不會有任何動物源性物質(zhì)，尤其是牛蛋白的混入，使得最終獲得的重組人蛋白中不含任何動物成分。這樣可避免動物病原體(如瘋牛病，克雅氏病等)的污染及外源蛋白引起的機體異種排斥和過敏反應(yīng)，因此細胞治療的體外細胞培養(yǎng)過程中最好使用無動物成分的重組細胞因子。
【其它相關(guān)試劑】
生產(chǎn)商 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品規(guī)格
PeproTech 重組人 Flt-3 Ligand (Animal Free) AF-300-19 10μg/50μg /100μg /250μg /500μg /1mg
PeproTech 重組人 IL-7 (Animal Free) AF-200-07 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg
PeproTech 重組人 IL-15 (Animal Free) AF-200-15 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg
PeproTech 重組人 SCF (Animal Free) AF-300-07 10μg /50μg /100μg /250μg /500μg /1mg
【參考文獻】
[1] Steinman RM, Cohn ZA. "Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution". J. Exp. Med. 1973; 137 (5):1142–62.
[2] 張志偉，宋鑫。DC-CIK細胞臨床制備規(guī)范化研究。中國腫瘤，2011；20(2)：85-88。
[3] Li R, Wang C, et al. Autologous cytokine-induced killer cell immunotherapy in lung cancer: a phase II clinical study. Cancer Immunol Immunother. 2012; 61:2125–2133.
一、高效CIK
高效CIK（High-efficiency cytokine-induced killer），即高效細胞因子誘導(dǎo)的殺傷細胞，是治療腫瘤和慢性傳染性病毒感染的細胞免疫治療方法之一。其技術(shù)是從患者自體外周血（20～100ml）中分離單個核細胞，經(jīng)過體外刺激擴增培養(yǎng)，使在生理條件下具有殺傷腫瘤細胞和病毒感染細胞的殺傷性效應(yīng)的細胞亞群，主要是CD8＋殺傷性T淋巴細胞（CTL，約70%）和自然殺傷細胞（NK，約10%）得到大量的擴增和活化，之后經(jīng)一次或多次回輸給患者。高效CIK作為細胞過繼性免疫治療方法，可有效輔助惡性腫瘤和慢性傳染性病毒感染的治療。
1. 高效CIK治療適應(yīng)癥
（一）確診為惡性腫瘤或EBV、CMV、HPV、HBV、HCV病毒感染；
（二）預(yù)期生存期＞3個月的患者；
（三）實驗室檢查必須符合下列條件：淋巴細胞絕對值＞0.8×109/L；
（四）病人有自知能力，能簽署知情或志愿同意書；
（五）患者依從性較好，能配合針對毒副反應(yīng)的治療；
（六）抗HIV（－），TPHA（－）；
2. 高效CIK治療禁忌癥
（一）合并顱內(nèi)高壓或意識不清的顱腦腫瘤；
（二）癥狀性心衰或嚴重心律失常；
（三）彌漫性血管性內(nèi)凝血；
（四）血清肌酐和/或尿素氮≥正常值的1.5倍；
（五）敗血癥或其他難以控制的感染；
（六）腸梗阻；
（七）經(jīng)治療后心臟病情仍不穩(wěn)定，入組前1個月內(nèi)出現(xiàn)過心肌梗塞；
（八）有癥狀的周圍神經(jīng)病變＞2級（NCIC-CTG標準）；
（九）不可控制的糖尿病；
（十）嚴重精神紊亂；
（十一）雙磷酸鹽難以控制的高鈣血癥，血鈣濃度＞12mg/100ml；
（十二）妊娠及哺乳期婦女；
（十三）合并傳染性疾�。喊滩 ⒚范镜�；
（十四）T淋巴細胞相關(guān)性淋巴瘤和白血病患者；
（十五）有嚴重的T淋巴細胞相關(guān)自身免疫病的患者；
（十六）因感染引起的發(fā)熱患者；
3. 高效CIK的治療方案
（一）單獨使用
適用人群 預(yù)期效果 使用方案
手術(shù)后無其他治療患者 預(yù)防復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移 •第一階段每周1次回輸，共4-6次回輸；
•第二階段每2周1次回輸，共4-6次回輸；
•此后可每3個月至半年進行每周1次×4次回輸；
所有其他治療無效腫瘤持續(xù)進展的患者 改善生活質(zhì)量穩(wěn)定腫瘤 •1周1次回輸，共6-8次回輸后評價療效；
•如患者要求，根據(jù)病情進展可持續(xù)進行每1-2周1次的回輸；
化療或放療有效但已停用，需維持治療效果的患者 長期維持腫瘤穩(wěn)定 •患者無腫瘤
o同手術(shù)后無其他治療患者方案；
•患者體內(nèi)仍有腫瘤
o第一階段每周1次回輸，共4-6次回輸；
o第二階段每2周1次回輸，共4次回輸；
o根據(jù)患者的要求，可長期進行每2周1次的回；
（二）與化療聯(lián)合使用
適用人群 預(yù)期效果 使用方案
正在進行化療（靜脈給藥）的患者（口服化療藥同單獨使用高效CIK治療方案） 改善生活質(zhì)量，消除化療副作用，與化療產(chǎn)生協(xié)同作用，殺傷腫瘤細胞維持腫瘤穩(wěn)定。 •三周化療方案
o化療靜脈給藥結(jié)束后48小時回輸、第9天回輸；
o自第一天給與化療計算，第7天、第14天回輸；
•四周化療方案
o化療第7天和第17天各回輸1次；
•8天化療，三周方案
o化療第3天、第10天回輸；
（三）與靶向治療聯(lián)合使用
適用人群 預(yù)期效果 使用方案
正在進行靶向治療的患者 通過ADCC作用與抗體類靶向治療產(chǎn)生協(xié)同作用，殺傷腫瘤改善靶向藥物引起的副作用維持腫瘤穩(wěn)定。 •根據(jù)靶向藥物的治療方案而定
o細胞回輸通常在每次靶向藥物給藥后48小時；
o靶向治療結(jié)束后高效CIK治療方案參考單獨使用方案；
4. 高效CIK血標本采集護理
（一）采血前做好患者的評估，包括病情、意識狀態(tài)、生命體征、正在進行的治療、靜脈充盈情況、患者的理解及合作能力；
（二）兩人核對患者的床號、姓名、住院號、采血時間、采血量等；
（三）告訴患者采血的目的和方法，讓患者放松情緒，避免緊張；
（四）采血時協(xié)助患者取平臥位或坐位，暴露靜脈，選擇粗、直、大靜脈，嚴格無菌操作采集血標本；
（五）采血過程中注意觀察患者面色、神志，詢問患者有無頭暈、心慌等不適，如患者有頭暈、乏力、心悸不適等情況即停止采血，報告醫(yī)生，協(xié)助處理，采血完成按壓穿刺點10min；
（六）將盛裝血標本試管輕柔180°顛倒搖勻5～8次，以達到更好的抗凝效果，然后將血標本裝于密封袋，貼上封條，存放于血樣箱（溫度4～8℃）立即送細胞實驗室進行培養(yǎng)；
（七）填寫細胞培養(yǎng)血標本采集護理記錄單。
5. 高效CIK血樣本采集注意事項
（一）采血前，患者可以飲溫開水、低脂清淡飲食；
（二）采血前，不可以進行任何輸液治療；
（三）采血前1天，患者不可以進行可能損傷、破壞淋巴細胞的治療和檢查項目，如放療、化療、核醫(yī)學(xué)檢查等；
（四）連續(xù)兩個療程治療時，取血和回輸細胞在時間上會有交叉，取血必須在細胞回輸之前；
（五）3天內(nèi)的血常規(guī)，要求白細胞在正常范圍，淋巴細胞絕對值大于0.8×109/L；
（六)采血量取決于患者淋巴細胞絕對數(shù)，采血量ml×淋巴細胞計數(shù)>0.8×109/L，約為20-100ml；
（七）如需凍存細胞，采血量需要增加；
（八）血標本采集后，置入4～8℃無菌運轉(zhuǎn)箱由專人及時送至實驗室，一般標本放置時間不能超過4h。
6.高效CIK回輸護理
（一）心理護理，如客觀講解CIK的療效及可能出現(xiàn)的副作用，消除患者及家屬的疑惑和恐懼心理，取得配合。細胞治療作為一種新療法給腫瘤患者帶來希望，但其療效存在個體差異，應(yīng)讓患者和家屬充分知情，可避免患者因不能達到預(yù)期的療效而出現(xiàn)心理落差；
（二）確定回輸時間，通知患者，根據(jù)治療需要合理安排回輸工作；
（三）CIK細胞送到病房，護士應(yīng)與實驗員核對病人姓名、住院號、CIK編號、制備日期、回輸日期、包裝是否完整、細胞質(zhì)量檢測結(jié)果等；
（四）經(jīng)外周靜脈給患者回輸，嚴格無菌操作，注意調(diào)節(jié)滴速，先慢后快；同時注意密切觀察患者的一般情況，如體溫、脈搏、呼吸、血壓等，輸注細胞前后均使用生理鹽水沖管；
（五）輸注過程中，密切巡視，5～10min輕輕擠壓傳輸袋底部，使沉淀細胞重新懸浮，以免細胞沉淀聚集；
（六）副作用的觀察及護理
1）發(fā)熱，CIK最常見副作用為發(fā)熱，常在回輸后1-2h內(nèi)發(fā)生，也有病人在回輸4h之后發(fā)生發(fā)熱反應(yīng)。發(fā)生發(fā)熱反應(yīng)首先向醫(yī)生匯報。一般情況，低、中度發(fā)熱時可不作特殊處理，囑患者多飲水；高熱時按醫(yī)囑冰敷等物理降溫或口服退熱藥物；患者寒戰(zhàn)時注意觀察病情變化，做好保暖，必要時給予吸氧；
2）變態(tài)反應(yīng)，患者出現(xiàn)皮疹、呼吸困難、心悸等反應(yīng)，臨床上極少見此類反應(yīng)，若出現(xiàn)變態(tài)反應(yīng)立即停止輸注，通知醫(yī)生，給予吸氧、抗過敏處理；
（七）回輸完畢，囑門診病人常規(guī)留觀30min, 如有不適及時告知護士；囑患者離院后如有病情變化，及時復(fù)診；
（八）觀察記錄病人情況，填寫細胞回輸護理記錄單。
7. 高效CIK回輸注意事項
（一）輸注細胞前必須經(jīng)過兩人核對無誤，方可輸入；
（二）認真檢查細胞質(zhì)量，查看細胞檢測報告；
（三）使用一次性輸血管，禁止使用帶精密過濾器的輸液管；使用7號或以上的頭皮針，避免小針頭產(chǎn)生的剪切力對細胞的損害；
（四）禁止在細胞內(nèi)加入其它藥物；
（五）注意輸注速度，起始速度30～40滴/min，觀察10min后如沒有特殊反應(yīng)，將滴速改為60～80滴/min，40～60分鐘內(nèi)輸完；
（六）細胞培養(yǎng)后要及時回輸，需要保存時必須放冰箱2～8℃保存不超過8h；
（七）放療、化療前后需間隔48小時以上方可進行細胞回輸，防止放療、化療殺傷CIK細胞，影響療效。
二、DC-CIK
隨著細胞制備技術(shù)的日趨完善，DC-CIK細胞過繼免疫治療在臨床逐漸開展，相關(guān)報道可見。實驗研究方面，Marten實驗研究表明：DC和CIK共培養(yǎng)可以同時促進CIK細胞和DC細胞的增殖和免疫功能。張嵩等的動物實驗研究表明：化療后應(yīng)用DC-CIK細胞可有效抑制腫瘤細胞生長，甚至使腫瘤完全消失；而且DC-CIK細胞的抗腫瘤效應(yīng)對集體免疫系統(tǒng)功能不產(chǎn)生危害，在當前對腫瘤特異性抗原了解相對較少的情況下，應(yīng)用DC-CIK細胞作為腫瘤放化療和手術(shù)后的輔助治療有重要的臨床意義。
1. 在白血病中的應(yīng)用
趙春華等研究表明：與DC共培養(yǎng)可使CIK細胞獲得更高的增殖速率和更強的體內(nèi)外抗腫瘤活性，DC-CIK細胞可以作為一種臨床有效的抗白血病免疫治療策略。童春容等臨床研究顯示：DC-CIK細胞治療具有明顯清除微小殘留白血病細胞防止復(fù)發(fā)的作用，并且靜脈輸注安全。
2. 在腫瘤中的應(yīng)用
將CIK細胞和同源DC細胞共培養(yǎng)后即可獲得DC-CIK細胞。它既可促進DC細胞的成熟，更能促進ClK的增殖，并加強其抗腫瘤活性。DC細胞是機體免疫應(yīng)答的始動者，能夠誘導(dǎo)持久有力的特異性抗腫瘤免疫反應(yīng)；CIK細胞可通過非特異性免疫殺傷作用清除腫瘤患者體內(nèi)微小殘余病灶，所以負載腫瘤抗原的DC與CIK的有機結(jié)合（即DC-CIK細胞）能產(chǎn)生特異性和非特異性的雙重抗腫瘤效應(yīng)。
三、DC治療對腫瘤治療的原理
①DC可以高表達MHC-Ⅰ類和MHC-Ⅱ類分子，MHC分子與其捕獲加工的腫瘤抗原結(jié)合，形成肽-MHC分子復(fù)合物，并遞呈給T細胞，從而啟動MHC-I類限制性CTL反應(yīng)和MHC-Ⅱ類限制性的CD4+ Thl反應(yīng)。同時，DC還通過其高表達的共刺激分子(CD80/B7-1、CD86/B7-2、CD40等)提供T細胞活化所必須的第二信號，啟動了免疫應(yīng)答。
②DC與T細胞結(jié)合可大量分泌IL-12、IL-18激活T細胞增殖，誘導(dǎo)CTL生成，主導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答，利于腫瘤清除；激活穿孔素P顆粒酶B和FasL/Fas介導(dǎo)的途徑增強NK細胞毒作用；
③DC分泌趨化因子(Chemotactic Cytokines， CCK)專一趨化初始型T細胞促進T細胞聚集，增強了T細胞的激發(fā)。保持效應(yīng)T細胞在腫瘤部位長期存在，可能通過釋放某些抗血管生成物質(zhì)(如IL-12、IFN-γ)及前血管生成因子而影響腫瘤血管的形成。上述CCK進一步以正反饋旁分泌的方式活化DC，上調(diào)IL-12及CD80、CD86的表達；同時DC也直接向CD8+T細胞呈遞抗原肽，在活化的CD4+ T細胞輔助下使CD8+ T細胞活化，CD4+和CD8+T細胞還可以進一步通過分泌細胞因子或直接殺傷，增強機體抗腫瘤免疫應(yīng)答。
四、ACTL
全稱“ AAV-DC-CTL靶向性抗腫瘤細胞免疫技術(shù)”，簡稱“ACTL™”或“ACTL技術(shù)”或“ACTL腫瘤細胞靶向治療”。
"ACTL™ Anti-Cancer Cellular Immunotherapy"
1. ACTL技術(shù)背景
2011年10月3日，加拿大科學(xué)家、美國醫(yī)學(xué)會和美國國家科學(xué)院院士拉爾夫•斯坦曼（Steinman）教授獲得2011年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎。斯坦曼獲獎的原因在于他在“樹突狀細胞（Dendritic Cell, DC細胞）及其在適應(yīng)性免疫系統(tǒng)方面作用的發(fā)現(xiàn)”。21世紀初，美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院腫瘤中心劉勇教授在斯坦曼教授的指引下將其研究的以重組腺相關(guān)病毒(Recombinant Adeno-associated Virus, rAAV)與斯坦曼教授研究的DC細胞相結(jié)合，研發(fā)以攜帶某種或數(shù)種特定腫瘤相關(guān)抗原決定簇基因的重組腺相關(guān)病毒轉(zhuǎn)染DC細胞，在體外刺激患者T淋巴細胞，產(chǎn)生特異性殺傷某種或數(shù)種腫瘤相關(guān)抗原陽性腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞（Cytotoxic Lymphocyte, CTL細胞），隨后進行相關(guān)的臨床試驗研究，獲得成功。此治療技術(shù)稱為ACTL腫瘤細胞靶向治療技術(shù)，已獲得5項國際專利保護，由此技術(shù)制備的特異性殺傷腫瘤相關(guān)抗原陽性腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞稱為特異殺傷性T細胞（ACTL，A代表特異性抗原）具有高效性、靶向性（即特異性）殺傷某種或數(shù)種特定腫瘤相關(guān)抗原陽性腫瘤細胞以及PSMA 陽性的腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞的強大功能，對正常細胞無損傷作用。
ACTL腫瘤細胞靶向治療技術(shù)臨床應(yīng)用的典型例子為斯坦曼教授自身晚期胰腺癌的治療和蘋果公司喬布斯晚期胰腺癌的治療。拉爾夫•斯坦曼（Steinman）教授僅采用了此治療技術(shù)，生存時間為4年。
在斯坦福大學(xué)腫瘤中心，經(jīng)過數(shù)年的臨床研究，于2010年證明了ACTL特異殺傷性T細胞不僅能夠直接靶向殺傷腫瘤細胞，而且可封閉腫瘤新生血管，發(fā)揮間接殺傷腫瘤細胞作用，明顯提升臨床療效。此項研究成果被2010年美國腫瘤臨床學(xué)會(ASCO)評為2010年度上半年腫瘤生物治療領(lǐng)域最重要的突破。
在美國進行的臨床研究表明，ACTL特異殺傷性T細胞不僅有可能逆轉(zhuǎn)婦科和前列腺等惡性腫瘤對抗激素治療產(chǎn)生的耐藥性，而且有可能逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對易_瑞_沙、阿_瓦_斯_丁等分子靶向藥物治療的耐藥性。
2. ACTL技術(shù)治療機理
AAV-DC-CTL™腫瘤細胞靶向治療技術(shù)是將無致病性的野生型腺相關(guān)病毒(Adeno-associated virus,AAV) 通過基因重組技術(shù)改建為攜帶特定腫瘤相關(guān)抗原決定簇基因的重組腺相關(guān)病毒，感染患者的外周血單核細胞 (Monocytes. Mo)，經(jīng)細胞因子誘導(dǎo)，單核細胞轉(zhuǎn)化為具有強大抗原提呈功能的DC細胞。經(jīng)此技術(shù)獲得的DC細胞在體外刺激患者的T淋巴細胞，產(chǎn)生有效殺傷腫瘤細胞的細胞毒性T淋巴細胞(CytotoxicT lymphocytes, CTL)。所產(chǎn)生的CTL 具有腫瘤抗原特異性，即靶向性，僅針對某種或數(shù)種特定腫瘤相關(guān)抗原陽性的腫瘤細胞以及PSMA 陽性的腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞具有殺傷作用，對抗原陰性的細胞無任何作用。
CTL細胞是CD8+的T細胞亞群，為一種特異T細胞，對某些病毒、腫瘤細胞等具有直接殺傷作用，與自然殺傷細胞構(gòu)成機體抗病毒、抗腫瘤的重要防線。CTL殺傷機制有：
推薦產(chǎn)品及相關(guān)產(chǎn)品匯總表：
一、CIK
生產(chǎn)商 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品規(guī)格 使用濃度
推薦產(chǎn)品
eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg
PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg
PeproTech 重組人IFN-γ (AF) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml
PeproTech 重組人IL-1α(AF) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重組人IL-2 (AF) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml
相關(guān)產(chǎn)品
PeproTech 重組人Flt-3 Ligand (AF) AF-300-19 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人IL-7 (AF) AF-200-07 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人IL-15 (AF) AF-200-15 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg
PeproTech 重組人SCF (AF) AF-300-07 10μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg
①釋放穿孔素，顆粒酶，裂解靶細胞。
②通過FasL介導(dǎo)靶細胞的凋亡。
二、 DC-CIK
生產(chǎn)商 產(chǎn)品名稱 產(chǎn)品編號 產(chǎn)品規(guī)格 使用濃度
推薦產(chǎn)品
eBioscience Anti-Human CD3 Functional Grade Purified 16-0037-85 500μg
PeproTech- biogems Anti-Human CD3 SAFIRE Purified 05121-25 100μg/500μg
PeproTech 重組人 GM-CSF (AF) AF-300-03 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 50-100ng/ml
PeproTech 重組人 IFN-γ(AF) AF-300-02 100μg/250μg/500μg/1mg 50ng/ml
PeproTech 重組人 IL-1α(AF) AF-200-01A 10μg/100μg/250μg/500μg/1mg 0.1ng/ml
PeproTech 重組人 IL-2 (AF) AF-200-02 50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 30ng/ml
PeproTech 重組人 IL-4 (AF) AF-200-04 20μg/50μg/100μg/250μg/500μg/1mg 100ng/ml
相關(guān)產(chǎn)品
PeproTech 重組人Flt-3 Ligand (AF) AF-300-19 10μg/50μg /100μg /250μg /500μg /1mg
PeproTech 重組人 IL-7 (AF) AF-200-07 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg
PeproTech 重組人 IL-15 (AF) AF-200-15 10μg /100μg /250μg /500μg /1mg
PeproTech 重組人 SCF (AF) AF-300-07 10μg /50μg /100μg /250μg /500μg /1mg
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