流式在微生物中的應(yīng)用-細(xì)菌檢測(cè)

在國(guó)外，流式細(xì)胞術(shù)(Flow cytometry, FCM)已在細(xì)菌常規(guī)工作中得到廣泛的應(yīng)用[1]，而在國(guó)內(nèi)起步較晚。目前已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室研究、工業(yè)生產(chǎn)、臨床診斷、環(huán)境評(píng)估等領(lǐng)域的細(xì)菌快速檢測(cè)有所應(yīng)用。

細(xì)菌研究中常需要是菌體計(jì)數(shù)，常規(guī)計(jì)數(shù)方法是平板法和顯微技術(shù)，缺點(diǎn)是誤差大和耗時(shí)長(zhǎng)，且平板法只能計(jì)數(shù)活菌。FCM可以同時(shí)克服耗時(shí)長(zhǎng)和誤差大的缺點(diǎn)，快速得到細(xì)菌總數(shù)，若檢測(cè)的是一定體積樣品中的菌數(shù)，即得知菌濃度，并可區(qū)分活菌和死菌，獲得活菌百分比。

FCM也可用于細(xì)菌鑒定。FCM檢測(cè)的熒光強(qiáng)度與DNA片段大小成比例，Kim等[2]研究結(jié)果表明，F(xiàn)CM得到的DNA大小與脈沖場(chǎng)凝膠電泳(PFGE)結(jié)果具有高度一致性，而FCM所需純化DNA樣品量為pg級(jí)，且只需10min對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析�？梢�(jiàn)，F(xiàn)CM有高度靈敏和快速的特點(diǎn)，是一種極具前景的細(xì)菌鑒定手段。

工業(yè)生產(chǎn)中，有時(shí)需要判斷菌體活性，確保生產(chǎn)效率。運(yùn)用FCM需選用膜非滲透性染料，如碘化丙錠(PI)，不能進(jìn)入具有完整細(xì)胞膜的活細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞死亡或細(xì)胞膜不完整時(shí)，PI滲入細(xì)胞內(nèi)嵌入DNA 堿基對(duì)中并與之結(jié)合，在488 nm的激光激發(fā)下，在波長(zhǎng)660 nm左右檢測(cè)到紅色熒光。因此，通過(guò)熒光信號(hào)的強(qiáng)弱或有無(wú)可知菌體活性的大小或有無(wú)，并且該方法可以檢測(cè)低活性的細(xì)胞；如果使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)法或亞甲基藍(lán)染色法檢測(cè)低活性細(xì)胞，則誤差較大。FCM可以作為產(chǎn)品質(zhì)量控制和菌群生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的重要手段，與傳統(tǒng)方法高度一致，結(jié)果可靠，且具有快速、靈敏、便捷的優(yōu)點(diǎn)。

流式細(xì)胞術(shù)具有快速、靈敏、精確并能進(jìn)行多參數(shù)分析的特點(diǎn)，可廣泛應(yīng)用于細(xì)菌的診斷和藥敏試驗(yàn)，是研究細(xì)菌異質(zhì)性、細(xì)菌抗生素后效應(yīng)、多種病原菌混合感染等的有效方法。FCM可快速檢測(cè)抗生素抗菌效應(yīng)，并利用細(xì)胞氧化活性染料CTC檢測(cè)出幾個(gè)不同的細(xì)胞亞群，因?yàn)椴煌��?xì)菌亞群對(duì)抗生素的敏感性不同，從而直觀地反映細(xì)胞異質(zhì)性。抗生素后效應(yīng)是指細(xì)菌與抗生素短暫接觸后清除藥物，而細(xì)菌生長(zhǎng)仍受到持續(xù)抑制的效應(yīng)。流式細(xì)胞儀對(duì)每一個(gè)細(xì)菌多參數(shù)檢測(cè)，可同時(shí)檢測(cè)到FSC、FL2變化，提供得出細(xì)菌體積增大和DN A含量增加，多參數(shù)反映細(xì)菌變化，提高了準(zhǔn)確性。

自從1993年Wagner等利用FCM對(duì)活性污泥中微生物進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)分析以來(lái)，該技術(shù)逐漸成為空氣、土壤、水等環(huán)境中微生物學(xué)研究中的一項(xiàng)重要工具。Joachimsthal等[3] 對(duì)新加坡港的壓艙水進(jìn)行了細(xì)菌總數(shù)、腸道菌數(shù)、弧菌數(shù)和大腸桿菌數(shù)的檢測(cè)，可以為壓艙水的污染狀況提供大量信息。Yamaguchi等[4]使用FCM分別對(duì)未污染和污染河水中細(xì)菌的呼吸活性和酯酶活性進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌體酯酶活性對(duì)污染狀況更敏感，有酯酶活性的細(xì)菌比例與河水污染程度呈正相關(guān)，可以此作為評(píng)估環(huán)境水污染的指標(biāo)。

浮游生物也是造成水質(zhì)破壞的一大因素，它們�？梢�起“水花”。所幸，F(xiàn)CM也可用于浮游生物的檢測(cè)。2012年，Quan Zhou等[5]利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)太湖湖底沉積物中的微胞藻屬菌體計(jì)數(shù)，并對(duì)微胞藻聚集體進(jìn)行了群落分析，表明FCM可以高效監(jiān)測(cè)微胞藻屬的群落變化，具有高度適用性。

流式細(xì)胞儀的基本原理及只要所需檢測(cè)微粒能用熒光染料標(biāo)記就能被定量檢測(cè)的特點(diǎn)，推測(cè)其可能用于趨磁細(xì)菌磁小體合成量的檢測(cè)。由于趨磁細(xì)菌體內(nèi)合成磁小體，且數(shù)量不等，所以磁小體的多少直接影響菌的胞內(nèi)粒度大小，依據(jù)FCM的側(cè)向散射光信息代表細(xì)胞的胞內(nèi)粒度情況，F(xiàn)CM可能是檢測(cè)趨磁細(xì)菌磁小體量的一種方法。當(dāng)然，這種方法只有能直接標(biāo)記磁小體才具有說(shuō)服力，但是目前尚未找到恰當(dāng)?shù)拇判◇w熒光探針，因此應(yīng)用上還有待于趨磁細(xì)菌研究的進(jìn)一步深入。

[1]  Bryan PT, Stefan MG, Eleftherios TP. Development and application of flow-cytometric techniques for
 analyzing and sorting endospore-forming Clostridia[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2008, 74(24): 7497-7506.

應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)畢赤酵母的細(xì)胞活性  微生物學(xué)通報(bào)  2006年33 (6) 2 2

[2] Kim Y, Jett JH, Larson EJ, et al. Bacterial finger-printing by flow cytometry: bacterial species discrimination
[J]. Cytometry, 1999, 36(4): 324-332.

[3] Joachimsthal EL, Ivanov V, Tay ST, et al. Bacteriological examination of ballast water in Singapore Harbour 
by flow cytometry with FISH[J]. Marine Pollution Bulletin, 2004, 49(4): 334-343. 

[4] Yamaguchi N, Nasu M. Flow cytometric analysis of bacterial respiratory and enzymatic activity in the natural
 aquatic environment[J]. Journal of Applied Microbiology, 1997, 83(1): 43-52.

[5] Zhou Q, Chen W, Zhang HY, et al. A flow cytometer based protocol for quantitative analysis of bloom-forming cyanobacteria (Microcystis) in lake sediments[J]. Journal of Environmental Sciences,
 2012, 24(9): 1709-1716.