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染色原理 |
熒光染料PI（碘化丙啶）是一種可對(duì)DNA染色的細(xì)胞核染色試劑，常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè)，英文全稱是Propidium Iodide。它是一種溴化乙啶的類似物，在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。 |
7-AAD 是一種核酸染料，它不能通過(guò)正常質(zhì)膜，隨著細(xì)胞凋亡、細(xì)胞死亡過(guò)程，質(zhì)膜對(duì)7-AAD的通透性逐漸增加，結(jié)合細(xì)胞凋亡中DNA的有控降解，在合適波長(zhǎng)激發(fā)光的激發(fā)下可發(fā)出明亮的紅色熒光，通過(guò)7-AAD標(biāo)記DNA的強(qiáng)弱，將細(xì)胞分為三群：7-AAD強(qiáng)為死亡細(xì)胞，7-AAD弱是凋亡細(xì)胞，7-AAD-為正常活力細(xì)胞。 |
DAPI可以穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中的雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)揮標(biāo)記的作用，可以產(chǎn)生比DAPI自身強(qiáng)20多倍的熒光，和EB相比，對(duì)雙鏈DNA的染色靈敏度要高很多倍。 |
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檢測(cè)通道 |
使用488 nm激發(fā)，用610/20 BP收集， FL-2檢測(cè)通道 |
用488nm激發(fā)，用670/14BP收集，F(xiàn)L-3檢測(cè)通道 |
用355nm激發(fā)，用440/40BP收集；也可用405nm激發(fā)，450/50BP收集 |
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使用方法
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（1)、用合適的方法誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
(2)、懸浮細(xì)胞離心（1500rpm 離心 5min）收集；貼壁細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化并用含血清培養(yǎng)基洗一次（注：胰酶消化時(shí)間不易過(guò)長(zhǎng)，否則容易引起假陽(yáng)性）；或直接用Accutase酶消化（無(wú)需終止）；1500rpm 離心 5min收集細(xì)胞；
(3)、用PBS洗滌細(xì)胞兩次（1500rpm離心5min）收集1-5 X105細(xì)胞，棄上清；
(4)、制備1X Binding Buffer緩沖液：按10次分析的量計(jì)算，加1ml 5X Binding Buffer緩沖液到4ml的去離子水；
(5)、用500ul 1X Binding Buffer重懸細(xì)胞(第4步稀釋的緩沖液）
(6)、加入5ul annexin-V FITC和10ul PI
(7)、避光室溫孵育5分鐘
(8)、上機(jī)檢測(cè) |
1.通過(guò)合適的方法來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；
2.清洗兩次細(xì)胞；在第二次清洗后，去除細(xì)胞顆粒殘留的PBS。
3.在冷的1X結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，使細(xì)胞濃度達(dá)到1 x 106 到1 x 107 cells/mL。
4.添加100ul細(xì)胞（106個(gè)）懸液到每管。
5.添加5 μl ofAnnexin V-PE 和 10μl的 7-AAD.
6.溫柔混勻，冰上孵育15分鐘。
7.不用清洗，添加1X結(jié)合緩沖液到每管。
8.流式數(shù)據(jù)分析。 |
1.稀釋DAPI儲(chǔ)存液到3 微摩染液（100mM Tris,PH7.4,150Mm,NaCl,
1mMCaCl2,0.5mM MgCl2,0.1%Nonidet P-40），每個(gè)細(xì)胞樣品中需要1 ML。
2.在室溫下，輕輕彈管使得細(xì)胞顆粒分散，添加5mL的PBS，讓細(xì)胞水化15分鐘。
3.離心上述的懸浮細(xì)胞，棄懸浮液。輕輕彈管使細(xì)胞分散，添加1ML的被染液稀釋的DAPI容液。
4.流式分析染料的存在。如果細(xì)胞在綠色熒光顯微鏡下能夠看到，離心樣本，去除上清，在新鮮的緩沖溶液中重懸。
5.提供一滴到顯微載玻片上，用蓋玻片蓋住，觀察。
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