干細(xì)胞治療在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)疾病中的應(yīng)用優(yōu)勢及前景

原創(chuàng): 彪彪 文章來源于：生物制品圈

摘要：軸突退化、炎癥、神經(jīng)元死亡和細(xì)胞架構(gòu)扭曲可能導(dǎo)致中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)損傷，如外傷、醫(yī)源性事件和神經(jīng)退行性疾病。由于缺乏前體細(xì)胞，成年哺乳動物神經(jīng)系統(tǒng)的再生能力受到限制。干細(xì)胞自我更新和分化成多種細(xì)胞類型的能力為解決這些障礙以改善神經(jīng)再生提供了新的治療潛力。迄今為止，干細(xì)胞治療在神經(jīng)系統(tǒng)再生中的潛在益處已受到關(guān)注。已有報道稱干細(xì)胞可治療缺血性腦損傷、周圍神經(jīng)損傷（PNI）和疼痛。干細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為新的神經(jīng)元和其他支持細(xì)胞以改善神經(jīng)再生并恢復(fù)功能。除了神經(jīng)營養(yǎng)因子外，有效的再生還涉及神經(jīng)元與不同細(xì)胞外基質(zhì)支持細(xì)胞之間的聯(lián)系。要被視為臨床上有效的治療選擇，必須解決有限的供體來源、不可控的細(xì)胞成熟、低細(xì)胞存活率和低植入率等問題。本章提供了關(guān)于在中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)疾病中應(yīng)用干細(xì)胞的研究綜述，主要是心臟驟停（CA）引起的全球性缺血性腦損傷和基于細(xì)胞的治療在PNI中的應(yīng)用。本章描述了CA和PNI模型的建立，評估了使用不同類型的干細(xì)胞和輸送方法后增強(qiáng)的結(jié)果，介紹了用于進(jìn)一步改善干細(xì)胞治療的技術(shù)，并為干細(xì)胞治療在神經(jīng)疾病中的前景提供了未來展望。

1.引言
神經(jīng)元或/和膠質(zhì)細(xì)胞的破壞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的全腦缺血和周圍神經(jīng)系統(tǒng)的周圍神經(jīng)損傷等常見神經(jīng)系統(tǒng)疾病的首要病理機(jī)制。近年來，干細(xì)胞治療作為一種新穎的替代策略，有望在神經(jīng)損傷后恢復(fù)神經(jīng)功能。臨床前研究表明，干細(xì)胞移植通過調(diào)節(jié)神經(jīng)炎癥和增強(qiáng)缺血性腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）的神經(jīng)發(fā)生來改善神經(jīng)學(xué)結(jié)果。干細(xì)胞治療已被報道可減少神經(jīng)病理性疼痛，促進(jìn)軸突再生和髓鞘再生，并最終增強(qiáng)神經(jīng)修復(fù)。幾項臨床研究表明干細(xì)胞在神經(jīng)損傷患者中的安全性和有效性。本章概述了干細(xì)胞治療在神經(jīng)損傷中的應(yīng)用，包括心臟驟停（CA）引起的腦缺血損傷和PNI。我們首先簡要介紹CA和PNI后干細(xì)胞輸送方法和損傷模型，然后總結(jié)干細(xì)胞治療對CA和PNI的有益效果。

2. 心臟驟停引起的全腦缺血性腦損傷中的干細(xì)胞治療
心臟驟停引起的全腦缺血性腦損傷是危重病醫(yī)學(xué)中神經(jīng)功能障礙的主要原因。心臟驟停后的腦損傷由腦暴露于缺血時的原發(fā)性損傷和隨后再灌注期間的繼發(fā)性損傷組成。在美國，每年大約有380,000例院外心臟驟停病例和290,000例院內(nèi)心臟驟停病例。盡管神經(jīng)保護(hù)藥物和目標(biāo)溫度管理取得了進(jìn)展，許多幸存者仍在與持續(xù)的殘疾作斗爭。需要新的治療方法來替代受損的神經(jīng)元以恢復(fù)神經(jīng)功能。實現(xiàn)有效的腦復(fù)蘇以挽救缺血性神經(jīng)元和加速受損神經(jīng)組織的修復(fù)以改善腦功能恢復(fù)已成為全球挑戰(zhàn)。干細(xì)胞治療因其擴(kuò)大修復(fù)效率和增強(qiáng)細(xì)胞分化的潛力而代表一種新的治療方法。干細(xì)胞移植通過包括神經(jīng)發(fā)生誘導(dǎo)、血管新生、細(xì)胞替代、軸突可塑性、髓鞘再生和神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)等潛在機(jī)制修復(fù)中風(fēng)后的局灶性缺血性腦損傷。在中風(fēng)患者中也報告了干細(xì)胞治療的治療效果。然而，全腦缺血性腦損傷中的干細(xì)胞治療報道較少。本節(jié)提供了在嚙齒動物CA模型中干細(xì)胞治療的概述，包括窒息CA模型、輸送途徑（腦內(nèi)室（ICV）和鼻內(nèi)給藥）以及干細(xì)胞治療后的神經(jīng)學(xué)結(jié)果。

2.1.心臟驟停和復(fù)蘇的實驗?zāi)Ｐ蛯嶒炐訡A模型包括電極植入、插管、插管和窒息CA。在異氟醚麻醉下使用立體定向裝置植入螺釘電極。記錄電極的位置分別是Bregma側(cè)1.5毫米、尾端2.0毫米和側(cè)3.0毫米、尾端1.5毫米。為了最小化噪聲，一個參考電極被放置在Bregma側(cè)1.5毫米、尾端1.4毫米。所有電極僅與硬腦膜輕輕接觸，并未穿透腦實質(zhì)。在CA當(dāng)天，麻醉動物被保持仰臥位，并使用14號氣管插管在喉鏡下插管至預(yù)定長度。氣管插管通過縫合固定在臉頰上，以防止移位和滑脫�；旌涎酢⒌�和異氟醚的呼吸機(jī)支持大鼠。使用股動脈導(dǎo)管監(jiān)測平均血壓（MAP）并收集血液進(jìn)行動脈血氣（ABG）測試。在窒息CA前通過靜脈給予維庫溴銨使大鼠癱瘓。通過關(guān)閉呼吸機(jī)和夾住氣管插管來誘導(dǎo)全腦窒息。MAP <10 mmHg、無脈動壓力波或心電靜止活動被定義為CA。通過解開氣管插管、重新啟動呼吸機(jī)、通過股靜脈給予腎上腺素和碳酸氫鈉以及持續(xù)的心肺復(fù)蘇（CPR）來開始復(fù)蘇。通過使MAP >60 mmHg，實現(xiàn)了自主循環(huán)恢復(fù)（ROSC）。根據(jù)ABG結(jié)果，相應(yīng)調(diào)整呼吸參數(shù)，如呼吸頻率、潮氣量和/或正壓呼氣末壓力（PEEP），以保持PCO2在35至45 mmHg之間。連續(xù)監(jiān)測腦電圖（EEG）、心電圖（ECG）、血壓和溫度。使用加熱墊將溫度控制在36.5-37.5°C。

2.2.心臟驟停后干細(xì)胞治療的輸送方法輸送干細(xì)胞的途徑包括靜脈注射（IV）、動脈內(nèi)注射（IA）、腦室內(nèi)（ICV）給藥、鼻內(nèi)給藥、顱內(nèi)（IC）注射和腹腔內(nèi)（IP）給藥。通過IV給藥將干細(xì)胞輸送到大腦的能力是有限的，一些細(xì)胞會積聚在外圍器官，如肺、肝、脾和腎臟。在人類中，通過靜脈注射的脂肪組織源干細(xì)胞治療中已有肺栓塞的報道。通過IA給藥繞過系統(tǒng)組織的攝取，以避免肺栓塞的風(fēng)險。然而，當(dāng)細(xì)胞在腦動脈中聚集時，可能導(dǎo)致腦缺血。通過IP途徑給藥的干細(xì)胞會被困在腹腔內(nèi)，只有部分穿透大腦。IC給藥能夠在目標(biāo)區(qū)域?qū)崿F(xiàn)更高的細(xì)胞濃度。然而，由于其侵入性，可能會引起局部腦損傷。ICV給藥通過腦脊液（CSF）擴(kuò)散將干細(xì)胞輸送到多個部位。鼻內(nèi)給藥是一種非侵入性方法，能夠穿過血腦屏障（BBB）。在確定干細(xì)胞治療的最佳輸送技術(shù)時，必須考慮幾個標(biāo)準(zhǔn)，包括實際可操作性、足夠的BBB穿透、輸送速度和特定靶向。本節(jié)討論了心臟驟停后ICV和鼻內(nèi)輸送干細(xì)胞治療的實驗方法。

2.2.1.心臟驟停后腦室內(nèi)注射干細(xì)胞復(fù)蘇后3小時，大鼠被放置在異氟醚麻醉下的立體定向裝置中。通過1-1.5厘米的皮膚切口使頭骨可見。使用高速鉆頭，在Bregma側(cè)1.5毫米、尾端1.2毫米處鉆ICV孔，深度為4毫米。干細(xì)胞被緩慢且連續(xù)地注入側(cè)腦室，超過一分鐘。針頭至少保留一分鐘以防止干細(xì)胞泄漏。然后逐漸拔出針頭。

2.2.2.心臟驟停后鼻內(nèi)給藥干細(xì)胞ROSC后3小時，通過每個鼻孔的滴管尖端給藥干細(xì)胞，以提高滲透性并促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入大腦。干細(xì)胞在右鼻孔和左鼻孔各注入兩次，每次給藥間隔10分鐘。每次給每個鼻孔注入10μl，直到總共注入40μl干細(xì)胞。

2.3.心臟驟停后干細(xì)胞治療的神經(jīng)學(xué)評估持續(xù)的氧氣和能量底物供應(yīng)對大腦組織的健康至關(guān)重要，當(dāng)腦血流中斷時，大腦的功能就會受損。這部分總結(jié)了多種評估心臟驟停引起的缺血性腦損傷后干細(xì)胞給藥神經(jīng)恢復(fù)的方法。包括定量電生理分析的定量腦電圖（qEEG）和體感誘發(fā)電位（SSEP）、神經(jīng)功能缺損評分（NDS）和組織病理學(xué)檢查在內(nèi)的經(jīng)過充分驗證的系統(tǒng)評估被介紹。重點介紹了ICV和鼻內(nèi)輸送策略的治療效果。動脈血氣（ABG）結(jié)果基線時和ROSC后20分鐘通過股動脈評估ABG測試，最多取0.05-0.1毫升血樣。所有呼吸機(jī)設(shè)置根據(jù)復(fù)蘇后的ABG結(jié)果相應(yīng)調(diào)整。神經(jīng)功能缺損評分和存活率臨床檢查、神經(jīng)影像學(xué)和電生理測試是主要的神經(jīng)生理預(yù)后措施。包括腦干反射在內(nèi)的臨床檢查已整合到經(jīng)過充分驗證的NDS檢查中，用于評估心臟驟停后的整體神經(jīng)行為功能（圖1）。NDS檢查基于以下標(biāo)準(zhǔn)分配了80分的總分：整體行為功能障礙、腦干功能、運動和感覺評估、運動行為、簡單行為反應(yīng)和癲癇發(fā)作。高級運動功能范圍為0至18。它使用子NDS分析進(jìn)行評估，包括走平衡木、步態(tài)協(xié)調(diào)、翻正反射、負(fù)地理定位、視覺放置和轉(zhuǎn)彎巷測試。在ROSC后6小時、24小時、48小時和72小時等多個時間點測試了聚合NDS和子NDS。記錄了過早死亡動物的存活時間，并使用Kaplan-Meier分析分析了72小時存活率。

圖 1 神經(jīng)功能缺損評分（NDS）。NDS持續(xù)時間<60被定義為嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損（SND）的閾值。* 高級運動功能的子NDS電生理評估包括正電子發(fā)射斷層掃描（PET）、磁共振成像（MRI）和計算機(jī)斷層掃描（CT）在內(nèi)的成像技術(shù)的進(jìn)步，使得建立新的成像標(biāo)志以預(yù)測心臟驟停后患者神經(jīng)障礙的長期恢復(fù)成為可能。由于它們有限的分辨率和對實時信息獲取的限制，迫切需要開發(fā)非侵入性技術(shù)以改善心臟驟停后功能結(jié)果預(yù)測。改進(jìn)的電生理監(jiān)測，重點關(guān)注腦電圖和SSEP，可以幫助以更高的靈敏度和特異性評估整體神經(jīng)功能損害的嚴(yán)重程度，并且可以方便地在床邊進(jìn)行。Jia的研究小組已經(jīng)研究了多模態(tài)預(yù)后指標(biāo)的有效性。腦電圖是通過一系列電極獲得的大腦電活動的記錄。在CA前，腦電圖被記錄為5分鐘的基線生理測量，并且在ROSC后的前6小時恢復(fù)期間進(jìn)行了連續(xù)記錄。定量腦電圖描述了腦電圖在一段時間內(nèi)的數(shù)學(xué)屬性。信息量化（IQ）是腦電圖信號的一種新的定量測量方法，腦電圖-IQ已被充分驗證為預(yù)測心臟驟停后神經(jīng)結(jié)果的良好指標(biāo)。所有腦電圖數(shù)據(jù)都被分析并以腦電圖-IQ的定量形式導(dǎo)出，使用MATLAB的核心算法。所有數(shù)據(jù)都標(biāo)準(zhǔn)化到基線。在CA時腦電圖波形幾乎變平，腦電圖-IQ值幾乎降至零。隨后，腦電圖信號和腦電圖-IQ值在復(fù)蘇后逐漸恢復(fù)。SSEP對皮質(zhì)和皮質(zhì)下缺血敏感，并且比腦電圖受鎮(zhèn)靜或低溫的影響較小。在CA之后，SSEP能更好地識別預(yù)后不佳的患者，而不是預(yù)測良好結(jié)果。作為心臟驟停后預(yù)后不良的最準(zhǔn)確的神經(jīng)生理預(yù)測因子，SSEP已被Jia和其他研究小組廣泛研究，以評估復(fù)蘇后的神經(jīng)結(jié)果。在臨床前研究中，評估定量SSEP信號的新技術(shù)顯示出預(yù)測CA后良好神經(jīng)結(jié)果的希望。定量SSEP可以幫助確定治療目標(biāo)，并預(yù)測大腦在復(fù)蘇后將如何恢復(fù)。除了當(dāng)前臨床治療標(biāo)準(zhǔn)中的N20峰值缺失/存在之外，SSEP是無意識心臟驟停患者預(yù)后良好的最早預(yù)測因子之一。在心臟驟停引起的缺血性腦損傷后，SSEP中特征峰值的延長潛伏期和振幅降低表明了受損的神經(jīng)傳導(dǎo)性。組織病理學(xué)評估甲苯胺藍(lán)染色用于識別海馬CA后缺血性損傷的神經(jīng)元。組織病理學(xué)損傷評分（HDS），定義為目標(biāo)區(qū)域死亡或缺血性神經(jīng)元的比例，被引入作為評估神經(jīng)元損傷的定量指標(biāo)。采用不同方法追蹤移植的干細(xì)胞。PKH26，一種紅色熒光染料，被選作預(yù)標(biāo)記移植的NSCs作為特定的細(xì)胞追蹤器。PKH26陽性NSCs主要分布在海馬CA1和大腦皮層區(qū)域，28天后通過ICV遞送途徑的CA。其他研究使用人類核Ku-86來識別移植的人類NSCs的遷移。NSCs腦室內(nèi)注射后72小時，Ku-86陽性細(xì)胞遷移并在CA大鼠的海馬區(qū)域主要發(fā)現(xiàn)。內(nèi)源性NSCs在齒狀回（DG）和側(cè)腦室下區(qū)（SVZ）區(qū)域豐富，可以在外來NSC治療后被誘導(dǎo)增殖和遷移。鑒于SVZ和腦室接近，ICV給藥可能更有效地激活SVZ細(xì)胞。因此，也評估了SVZ內(nèi)源性NSCs增殖和遷移以增強(qiáng)神經(jīng)發(fā)生的能力。

2.3.1.用腦室內(nèi)注射干細(xì)胞治療CA誘導(dǎo)的缺血性腦損傷基線ABG結(jié)果和電生理評估CA前不同組大鼠的基線條件是可比的，包括呼吸（pH，PCO2，PO2，HCO3^-，基礎(chǔ)過量和SO2）和器官灌注（乳酸）在內(nèi)的基線ABG結(jié)果沒有顯著差異。電生理EEG-IQ評估顯示，干細(xì)胞治療組和非治療組在ROSC后3小時內(nèi)的EEG-IQ值相似，表明通過ICV給藥的干細(xì)胞治療前EEG所指示的神經(jīng)恢復(fù)是相同的。神經(jīng)功能缺損評分和存活率NDS評估顯示，通過腦室內(nèi)注射NSCs的干細(xì)胞治療顯著改善了CA后缺血性腦損傷的神經(jīng)結(jié)果，表現(xiàn)為ROSC后NDS隨時間逐漸增加，干細(xì)胞治療組的NDS表現(xiàn)更好。ROSC后3小時ICV遞送NSCs增強(qiáng)了神經(jīng)功能的恢復(fù)，如更好的聚合NDS所示以及在ROSC后48小時和72小時的運動功能和行為的子NDS。Kaplan-Meier分析還顯示了存活率的有利結(jié)果。ICV移植NSCs提高了CA后全腦缺血的存活率。組織病理學(xué)評估組織病理學(xué)評估顯示，無論是NSC治療組還是僅CA組，在CA后海馬CA2和CA3區(qū)域都有高密度的受損缺血性神經(jīng)元。在ROSC后3小時將2.0×10^5 NSCs注入側(cè)腦室，保護(hù)了經(jīng)歷8分鐘窒息CA的大鼠大腦中的神經(jīng)元免受缺血。移植的NSCs顯著降低了海馬CA2區(qū)域的HDS。免疫熒光染色顯示了移植NSCs的分化，神經(jīng)發(fā)生的增強(qiáng)，以及干細(xì)胞治療在CA中的神經(jīng)保護(hù)涉及的潛在機(jī)制。ICV遞送NSCs增加了SVZ內(nèi)源性NSCs的增殖和遷移，以促進(jìn)CA后的神經(jīng)發(fā)生。NSC治療在CA后上調(diào)了與Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路相關(guān)的蛋白質(zhì)表達(dá)，這可能有助于干細(xì)胞治療對神經(jīng)恢復(fù)的治療效果。ICV移植后28天，在海馬和皮層中PKH26陽性和NeuN（神經(jīng)元標(biāo)記）陽性細(xì)胞的共定位驗證了從移植NSCs到神經(jīng)元的分化。

2.3.2.用鼻內(nèi)注射干細(xì)胞治療CA誘導(dǎo)的缺血性腦損傷基線ABG結(jié)果不同組大鼠在CA前的基線條件相似。包括呼吸（pH，PCO2，PO2，HCO3^-，基礎(chǔ)過量和SO2）和器官灌注（乳酸）在內(nèi)的基線ABG結(jié)果沒有顯著差異。神經(jīng)功能缺損評分Wang等人研究了鼻內(nèi)遞送NSCs在8分鐘窒息CA大鼠中的療效，并比較了NSC治療和格列本脲（GBC）治療的療效。在ROSC后3小時鼻內(nèi)遞送0.4×10^6 NSCs顯著改善了所有評估時間點（24小時，48小時和72小時）后的總體存活NDS。與GBC治療相比，NSC治療顯示出更好的神經(jīng)保護(hù)效果，如CA大鼠24小時后更好的NDS恢復(fù)所示。NSCs治療的動物顯示了嚴(yán)重神經(jīng)功能缺損（SND）的持續(xù)時間縮短，定義為NDS<60的持續(xù)時間，表明通過鼻內(nèi)途徑在早期階段的NSC治療縮短了ROSC后嚴(yán)重條件的時間。干細(xì)胞治療在外周神經(jīng)損傷中的應(yīng)用外周神經(jīng)損傷（PNI）指的是對周圍神經(jīng)干或分支造成不同程度的損傷。PNI可能導(dǎo)致結(jié)構(gòu)性損害，從而導(dǎo)致運動和感覺功能的局部或完全喪失、神經(jīng)病理性疼痛和身體殘疾，進(jìn)而嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。PNI在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中很常見，據(jù)估計美國約有2000萬人受影響。盡管顯微外科技術(shù)取得了進(jìn)展，修復(fù)神經(jīng)損傷仍然是臨床上難以解決的問題。雪旺細(xì)胞對神經(jīng)再生至關(guān)重要。然而，獲取雪旺細(xì)胞的侵入性質(zhì)限制了基于雪旺細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用。干細(xì)胞作為具有眾多再生優(yōu)勢的雪旺樣細(xì)胞來源，已成為有希望的替代性基于細(xì)胞的治療。干細(xì)胞分化成雪旺樣細(xì)胞時，可以加速巨噬細(xì)胞的募集和壞死細(xì)胞碎片的吞噬。同時，干細(xì)胞分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子以增強(qiáng)軸突生長，包括神經(jīng)生長因子（NGF）、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（GDNF）。此外，干細(xì)胞治療促進(jìn)再生治療中的再髓鞘化。在本節(jié)中，我們介紹了實驗性PNI模型、干細(xì)胞遞送途徑、干細(xì)胞移植后的功能結(jié)果以及改進(jìn)PNI干細(xì)胞治療的策略。

3.1.外周神經(jīng)損傷的實驗?zāi)Ｐ秃透杉?xì)胞移植周圍神經(jīng)病變可能由外傷引起。在臨床前模型中，神經(jīng)擠壓和橫斷傷是最常用的模擬外傷性PNI的方法。此外，PNI可能導(dǎo)致神經(jīng)病理性疼痛中的痛覺過敏和中樞敏化。其他主要關(guān)注神經(jīng)病理性疼痛的PNI模型包括慢性背根神經(jīng)節(jié)壓迫（CCD）模型、慢性束縛傷（CCI）模型和脛神經(jīng)及腓腸神經(jīng)橫斷模型。這里，我們介紹了這些PNI模型以及PNI后干細(xì)胞的管理。

3.1.1.神經(jīng)擠壓傷模型嚙齒動物的神經(jīng)擠壓傷模型是模擬外傷性PNI的最常用方法之一，先前已有報道。簡而言之，坐骨神經(jīng)被小心暴露，然后被擠壓10秒，每個間隔放松10秒，直到總擠壓時間為30秒。干細(xì)胞直接管理在坐骨神經(jīng)的擠壓傷處。

3.1.2.坐骨神經(jīng)橫斷和修復(fù)模型完全坐骨神經(jīng)橫斷是模擬患者嚴(yán)重外傷性PNI的典型嚴(yán)重PNI。坐骨神經(jīng)橫斷傷和修復(fù)模型已經(jīng)建立并描述得很好。簡而言之，動物通過吸入氧氣和異氟醚的混合物在面罩下麻醉。經(jīng)過無菌準(zhǔn)備后，腿部皮膚和肌肉被分層分離以暴露坐骨神經(jīng)。為了產(chǎn)生超出周圍神經(jīng)系統(tǒng)有限再生能力的顯著神經(jīng)間隙，切除了坐骨神經(jīng)分叉點近端0.5厘米處的15毫米長的坐骨神經(jīng)，這是大鼠中的關(guān)鍵尺寸神經(jīng)間隙。近端和遠(yuǎn)端神經(jīng)殘端各插入1毫米到17毫米長的神經(jīng)導(dǎo)管中，使用9-0縫合線創(chuàng)建15毫米的缺陷距離。在顯微鏡下，神經(jīng)殘端在每側(cè)使用9-0縫合線縫合。在坐骨神經(jīng)橫斷手術(shù)期間，使用神經(jīng)導(dǎo)向?qū)Ч芑蜃泽w神經(jīng)殘端修復(fù)坐骨神經(jīng)間隙。干細(xì)胞直接遞送到聚己內(nèi)酯納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管中。根據(jù)實驗設(shè)計，將PBS注入導(dǎo)管或無細(xì)胞支架可作為對照組。

3.1.3.復(fù)雜神經(jīng)損傷模型復(fù)雜神經(jīng)損傷模型是一種新穎的坐骨神經(jīng)損傷和修復(fù)模型，模擬影響運動和感覺通路的復(fù)雜外傷性PNI。坐骨神經(jīng)在其分叉點近端和遠(yuǎn)端0.5厘米處被切割1厘米長。在顯微鏡下，使用9-0縫合線將每個神經(jīng)殘端的神經(jīng)外膜附著到每側(cè)的神經(jīng)支架上。遠(yuǎn)端運動通道縫合到腓腸肌的脛神經(jīng)運動分支，遠(yuǎn)端感覺通道縫合到腓腸神經(jīng)，近端通道縫合到坐骨神經(jīng)。然后，皮膚和肌肉切口的各層被縫合在一起。干細(xì)胞直接遞送到3D神經(jīng)導(dǎo)管中。這種獨特的損傷模型使得在復(fù)雜PNI后，無論是否管理干細(xì)胞，都能在運動和感覺上進(jìn)行再生演變。

3.1.4.背根神經(jīng)節(jié)慢性壓迫模型CCD是腰椎間盤突出癥和根性疼痛的臨床前PNI模型。CCD模型已經(jīng)建立并報道了椎間孔狹窄的方法。在皮膚和肌肉無菌解剖后，L4和L5的橫向過程和椎間孔可見。兩個無菌不銹鋼L形桿（4毫米長，直徑0.63毫米）被插入L4和L5的孔中。在收集背根神經(jīng)節(jié)（DRGs）時，驗證了桿的正確位置。在CCI模型中采用了直接經(jīng)皮注射細(xì)胞移植的方法。在異氟醚麻醉下，通過L4和L5之間的間隙推進(jìn)帶有干細(xì)胞的HAMILTON微量注射器到達(dá)蛛網(wǎng)膜下腔。在通過尾 flick確認(rèn)針頭位置在蛛網(wǎng)膜下腔后，謹(jǐn)慎且緩慢地注射干細(xì)胞。

3.1.5.慢性束縛傷模型神經(jīng)病理性疼痛的另一個常見PNI模型是通過單側(cè)松散結(jié)扎坐骨神經(jīng)的CCI模型。CCI模型通過在坐骨神經(jīng)分叉近端松散地打四個3-0鉻腸線結(jié)扎引起。結(jié)扎被仔細(xì)且緩慢地進(jìn)行，以確保神經(jīng)的直徑可見且只有輕微的收縮。在CCI模型中，干細(xì)胞的局部應(yīng)用直接靠近神經(jīng)、IP注射或IV遞送已被報道。

3.1.6.脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)橫斷模型這種嚙齒動物PNI模型通常涉及橫斷脛神經(jīng)和/或腓腸神經(jīng)以誘導(dǎo)機(jī)械性過敏。一旦分叉完全暴露并確認(rèn)結(jié)構(gòu)，就從它們的起源處2毫米的距離移除脛神經(jīng)和腓腸神經(jīng)各2毫米的片段。常見的腓總神經(jīng)沒有被觸摸，保持完整。像在坐骨神經(jīng)損傷和修復(fù)模型中管理的干細(xì)胞一樣，使用含有干細(xì)胞的神經(jīng)導(dǎo)向?qū)Ч軄硇迯?fù)神經(jīng)間隙。

3.2.周圍神經(jīng)損傷后干細(xì)胞治療的系統(tǒng)評估
3.2.1.電生理評估電生理記錄在損傷前后均使用Tucker-Davis Technologies系統(tǒng)（TDT，Alachua，F(xiàn)L）通過前置放大器進(jìn)行。記錄針電極放置在遠(yuǎn)端坐骨神經(jīng)或腓腸肌內(nèi)。接地電極放置在動物尾部以最小化噪聲。放置在神經(jīng)近端的電極接受500 μA或1 mA的刺激，脈沖寬度為100 μs，頻率為0.5 Hz。同時記錄了脛骨前肌的電機(jī)誘發(fā)電位（MEP）和遠(yuǎn)端神經(jīng)的復(fù)合電機(jī)動作電位（CMAP）。每個刺激重復(fù)四次，每次持續(xù)1分鐘，間隔2分鐘以供放松。記錄在受傷和未受傷的兩側(cè)均進(jìn)行。在MEP和CMAP中分別分析M波以及潛伏期和峰峰幅度。基于信噪比設(shè)置了一個閾值來檢測峰值，該閾值是信號均值的兩到三倍標(biāo)準(zhǔn)差以上。如果峰值低于此閾值，則被認(rèn)為是噪聲。Du等人研究了神經(jīng)嵴干細(xì)胞（NCSC）治療在周圍神經(jīng)損傷（PNI）后的治療效果，在五個實驗組中進(jìn)行了研究，包括空白對照組、NCSC治療組、電刺激（ES）組、基于體外研究的聯(lián)合NCSC和優(yōu)化ES治療組以及自體神經(jīng)移植組。優(yōu)化的ES增強(qiáng)了2×10^6 NCSCs的治療效果，提高了大鼠PNI后神經(jīng)傳導(dǎo)性。在NCSC治療組和聯(lián)合NCSC與優(yōu)化ES組中觀察到CAMP和MEP中更多的可檢測信號，顯示了干細(xì)胞治療在坐骨神經(jīng)橫斷和修復(fù)后神經(jīng)再生的有益效果。在另一項利用大鼠坐骨神經(jīng)損傷和修復(fù)模型的研究中，Du等人比較了移植5代（p5）或6代（p6）NCSCs后神經(jīng)恢復(fù)情況，電生理評估表明，用5代NCSCs治療的大鼠比用6代NCSCs治療和未治療動物有更好的可檢測CMAP和MEP信號，從而驗證了NCSCs在大鼠PNI后的效果，其中p5 NCSCs優(yōu)于p6 NCSCs。

3.2.2.Catwalk步態(tài)分析Catwalk，一種步態(tài)分析工具，已在臨床前研究中得到很好的建立，用于評估步態(tài)恢復(fù)。大鼠在手術(shù)前一周開始每天在Catwalk系統(tǒng)上訓(xùn)練，直到它們能夠連續(xù)成功穿越走道三到五次而不停止。在測試當(dāng)天，大鼠在走道上自由行走，并在走道上左右移動。當(dāng)大鼠爪子接觸走道的玻璃板時，照亮的接觸區(qū)域被自動記錄（圖2）。每只大鼠總共完成三到五次連續(xù)、不間斷的跑步。Catwalk系統(tǒng)自動從以下指標(biāo)中收集兩只后肢的數(shù)據(jù)：給定爪子的總打印區(qū)域（打印區(qū)域）、打印的平均壓力（平均強(qiáng)度）、每步承重時間（站立時間）、每個步行周期中承重時間的百分比（占空比）、步間肢體速度（擺動速度）和步間距離（步幅長度）。對側(cè)后爪被用作比較對照，以避免動物體重和步行速度的混雜效應(yīng)。計算受傷同側(cè)后肢與對側(cè)健康后肢的比率，并調(diào)整到基線同側(cè)/對側(cè)比率。與對側(cè)標(biāo)準(zhǔn)化的目標(biāo)是減少因體重和跑步校準(zhǔn)引起的方差。所有數(shù)據(jù)都轉(zhuǎn)換為百分比，并由對側(cè)的健康腿進(jìn)行歸一化。開發(fā)并采用了一種手動處理方法，用于錯誤校正，以確保正確分析并從Catwalk軟件的自動分析中去除錯誤，以驗證所有跑步。首先，任何未分類的腳印都被相應(yīng)地分配到正確的肢體。其次，所有噪聲信號，包括來自鼻子、尾巴、腹部和生殖器的信號，都被手動標(biāo)記為“垃圾”。第三，被錯誤識別為屬于多個爪子的單個腳印被更正為單個步驟。每個肢體需要至少兩個步驟來計算動態(tài)數(shù)據(jù)，如占空比、擺動速度和步幅長度。少于兩個步態(tài)周期的跑步不包括在分析中。在PNI后使用2×10^6 NCSCs的基于細(xì)胞的治療改善了大鼠坐骨神經(jīng)橫斷和修復(fù)模型的恢復(fù)結(jié)果。手術(shù)修復(fù)后，站立時間、擺動速度和平均強(qiáng)度從第6周逐漸增加到第12周。前肢強(qiáng)度從第2周至第6周的改善表明了PNI后運動功能的逐漸恢復(fù)。與非治療組相比，NCSC治療顯著延長了站立時間，并在坐骨神經(jīng)損傷后12周增加了主要強(qiáng)度�？傮w比較顯示，NCSC組在手術(shù)后6周的占空比大于非治療組。NCSC治療在坐骨神經(jīng)橫斷后2周和12周增加了步幅長度。NCSC移植與優(yōu)化ES促進(jìn)了大鼠坐骨神經(jīng)橫斷和修復(fù)后的功能步態(tài)恢復(fù)，導(dǎo)致PNI后6周和12周的站立時間和占空比延長。步態(tài)分析表明，NCSC治療組在坐骨神經(jīng)損傷后12周顯示出更協(xié)調(diào)的前肢和后肢腳印、更大的平均強(qiáng)度和更長的占空比。Catwalk分析還證實，用5代NCSCs治療比6代NCSCs治療有更優(yōu)越的步態(tài)恢復(fù)。用NCSCs治療PNI在步態(tài)分析中顯示出有利的結(jié)果。與接受無細(xì)胞支架的大鼠相比，接受NCSC治療的大鼠顯示出更高的站立指數(shù)和最大強(qiáng)度。

圖 2 Catwalk分析系統(tǒng)的代表性圖片。(a) 大鼠從Catwalk XT系統(tǒng)的一端1.0米封閉走道移動到另一端。前肢和后肢的腳印都被自動捕獲。(b-e) Catwalk系統(tǒng)中由“自動分類”功能引起的典型錯誤示例，以及手動校正和調(diào)整。(b) 檢測到未分類的右后肢步態(tài)。通過指定適當(dāng)?shù)念悇e進(jìn)行更正。(c) 由于垃圾顆粒被歸類為步態(tài)，導(dǎo)致不準(zhǔn)確的跑步分類。通過將垃圾顆粒識別為“JUNK”來修復(fù)錯誤。(d) 單個步態(tài)被分類為兩個步態(tài)。合并步態(tài)以進(jìn)行更正。(e) 動物改變方向并以前左后肢為支點向右轉(zhuǎn)。通過移除受不良依從性影響的步態(tài)進(jìn)行更正。

3.2.3.痛覺相關(guān)行為測試痛覺行為測試，包括機(jī)械撤退閾值（MWT）和熱撤退潛伏期（TWL），用于評估PNI后感覺功能的恢復(fù)。使用電子機(jī)械鎮(zhèn)痛測試儀確定MWT。將玻璃箱放置在金屬框架篩上。大鼠在實驗前30分鐘被放置在箱中以適應(yīng)環(huán)境。電子機(jī)械刺激器的截止力設(shè)置為50克。測試針觸碰大鼠后爪的內(nèi)側(cè)足底表面，直到表現(xiàn)出逃跑行為�？焖俪吠嘶蜃ψ宇澏侗灰暈殛栃苑磻�(yīng)。每只大鼠進(jìn)行三次測試，每次評估之間休息5分鐘。每只動物的MWT計算為連續(xù)三次檢查的平均值。使用自動熱痛刺激器檢測TWL。將玻璃箱放置在3毫米厚的玻璃板上，輻射燈在桌子下方。大鼠在實驗前30分鐘被放置在箱中以適應(yīng)環(huán)境。在測試期間，刺激溫度設(shè)置為45°C。使用光照射刺激下肢足底表面，直到發(fā)生撤退反應(yīng)。當(dāng)大鼠抬起或舔其后爪時，疼痛潛伏期的記錄結(jié)束。為了防止組織損傷，設(shè)定了25秒的截止時間。每只大鼠進(jìn)行了三輪測試，每輪間隔5分鐘，所有三次測試結(jié)果的平均值被確定為此次測量的TWL。鞘內(nèi)遞送BMSCs顯示出對CCD的機(jī)械痛覺過敏有強(qiáng)烈且短暫的緩解作用。CCD動物在MWT中表現(xiàn)出更長時間的爪子撤退和更多的舔舐行為�；�于BMSCs的細(xì)胞治療在治療后1天顯著減輕了這些痛覺過敏行為，表現(xiàn)為爪子撤退時間減少。外周遞送NCSCs減輕了坐骨神經(jīng)橫斷引起的疼痛。在PNI后12周觀察到下肢足底表面的機(jī)械和熱痛覺過敏。用外周給藥的NCSCs在NWT和TWL測量中緩解了坐骨神經(jīng)橫斷引起的疼痛。

3.2.4.修改的Wall評分自殘行為是PNI后去神經(jīng)支配肢體的常見行為，在嚙齒動物模型中，特別是在坐骨神經(jīng)損傷后的大鼠中，其發(fā)生率幾乎達(dá)到40-80%。使用修改的Wall評分每周進(jìn)行自殘評估，以檢查手術(shù)足自殘行為。0分表示無自殘。對于每個受影響的手指，指甲損傷給予1分，影響指骨的損傷給予2分，影響掌骨的損傷給予3分。修改的Wall評分范圍從0到15分。PNI后嚴(yán)重自殘被定義為修改的Wall評分超過4分。每周計算修改的Wall評分，以評估裸鼠和Wistar大鼠在接受NCSCs治療后PNI的自殘行為�？傮w而言，與Wistar大鼠相比，裸鼠在坐骨神經(jīng)橫斷后表現(xiàn)出較少的自殘行為。在坐骨神經(jīng)橫斷損傷后2、4、6、9和12周，Wistar大鼠的Wall自殘評分高于裸鼠，并且在Wistar大鼠中觀察到更高頻率的嚴(yán)重自殘類型（修改的Wall評分≥4）。在第一周內(nèi)，裸鼠和Wistar大鼠的自殘發(fā)生率較低，隨后從第2周至第6周急劇增加，并持續(xù)整個12周實驗。

3.2.5.肌肉質(zhì)量測量在PNI中坐骨神經(jīng)橫斷后，神經(jīng)肌肉支配被阻斷，導(dǎo)致去神經(jīng)支配的腓腸肌萎縮。肌肉質(zhì)量測量是評估PNI后功能恢復(fù)的另一個重要指標(biāo)。在安樂死后，仔細(xì)收集受傷和未受傷側(cè)的腓腸肌，并記錄肌肉重量。為了消除不同體重對絕對肌肉重量的混雜效應(yīng)，應(yīng)用腓腸肌指數(shù)（GMI）來評估PNI引起的萎縮后肌肉質(zhì)量恢復(fù)的程度。GMI是通過將受傷側(cè)的腓腸肌質(zhì)量除以未受影響的對側(cè)質(zhì)量來計算的。在NCSC治療組、自體移植治療組和非治療組之間，腓腸肌重量顯示出不同的恢復(fù)。在6周和12周時，自體移植治療的腓腸肌重量高于NCSC和僅導(dǎo)管非治療組。與非治療和僅ES治療組相比，NCSC治療和優(yōu)化ES進(jìn)一步減輕了肌肉萎縮，這兩組在恢復(fù)12周后肌肉更小。NCSCs與優(yōu)化ES的聯(lián)合治療在坐骨神經(jīng)橫斷后6周和12周顯示出最高的GMI。在非治療組中，腓腸肌的纖維橫截面積顯示出形狀不規(guī)則的小纖維。相比之下，NCSC組的腓腸肌顯示出均勻分布的纖維直徑和規(guī)則大小。給予5代NCSC或6代NCSCs減少了腓腸肌中的脂肪浸潤和肌小節(jié)變性，顯示出更健康的肌肉纖維。3.2.6.組織病理學(xué)評估甲苯胺藍(lán)染色使核酸呈現(xiàn)藍(lán)色，多糖呈現(xiàn)紫色。甲苯胺藍(lán)染色的神經(jīng)切片的組織形態(tài)可以用來定量分析干細(xì)胞治療后的有髓纖維。在電子顯微鏡下檢查髓鞘的外緣和內(nèi)緣的長度，以定量分析纖維直徑（FD）和軸突直徑（AD）。根據(jù)纖維和軸突直徑計算髓鞘厚度（髓鞘厚度 = FD - AD）。用2×10^6 NCSCs治療促進(jìn)了坐骨神經(jīng)損傷和修復(fù)后的再髓鞘化。細(xì)胞計數(shù)分析顯示，在神經(jīng)修復(fù)后6周和12周，NCSC治療組的有髓軸突更多。在另一項研究中，對照組再生神經(jīng)組織在6周和12周時顯示出稀疏或小片狀，表明在橫斷后存在15毫米的神經(jīng)間隙，再生不成功。經(jīng)過NCSCs治療后，有髓軸突數(shù)量增多，有髓軸突密度增強(qiáng)，軸突直徑增加，髓鞘厚度增加。免疫熒光染色顯示，人NCSC治療在大鼠坐骨神經(jīng)橫斷損傷模型中增強(qiáng)了神經(jīng)再生，人NCAM（人細(xì)胞系標(biāo)記）、微管蛋白（軸突標(biāo)記）和S-100（施萬細(xì)胞標(biāo)記）的熒光信號更強(qiáng)。5代NCSCs的治療效應(yīng)優(yōu)于6代NCSCs在坐骨神經(jīng)損傷治療中的效果。嘌呤受體P2X4（也稱為P2X4R），是離子型ATP受體的一個亞型，被認(rèn)為在痛覺過敏的發(fā)病機(jī)制中特別重要，通過免疫組化和Western blot在大鼠CCD模型中上調(diào)。體外，BMSC治療后激活的小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X4R的表達(dá)水平下降。體內(nèi)，鞘內(nèi)注射BMSCs下調(diào)了脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞中P2X4R的表達(dá)，但不影響DRG神經(jīng)元中TRPV4的表達(dá)。鞘內(nèi)給藥BMSCs在PNI后緩解疼痛的主要機(jī)制可能包括P2X4R的調(diào)節(jié)。

3.3.提高周圍神經(jīng)損傷中干細(xì)胞治療的效果
3.3.1.聯(lián)合治療電刺激電場可以通過調(diào)節(jié)離子通道分布來增強(qiáng)細(xì)胞增殖、遷移和軸突生長。優(yōu)化的電刺激（ES）在大鼠坐骨神經(jīng)橫斷模型中進(jìn)一步改善了NCSC治療的神經(jīng)保護(hù)效果�；�于體外NCSCs形態(tài)變化和細(xì)胞分化改善，確定了優(yōu)化的刺激參數(shù)（200 mV/mm強(qiáng)度和100 ms持續(xù)時間）。這種優(yōu)化的ES促進(jìn)了NCSCs的分化和增殖。微管蛋白免疫染色顯示軸突再生的神經(jīng)保護(hù)效果，NCSC+ES治療比單獨NCSC治療更有效。NCSC+ES治療還促進(jìn)了有髓軸突密度、軸突直徑和髓鞘厚度的增加，改善了神經(jīng)傳導(dǎo)性，減輕了肌肉萎縮，并加速了步態(tài)恢復(fù)。與NCSC治療相比，NCSC與優(yōu)化ES的聯(lián)合治療顯示出更顯著的治療效果，表明優(yōu)化的ES增強(qiáng)了大鼠坐骨神經(jīng)損傷和修復(fù)后干細(xì)胞治療的效果。

電針將MSCs和電針（EA）治療結(jié)合起來治療急性坐骨神經(jīng)損傷，加速了髓鞘再生，增強(qiáng)了軸突延伸，并最終促進(jìn)了PNI后大鼠的功能恢復(fù)。MRI監(jiān)測顯示，與PBS對照組相比，MSCs治療組在3周和4周時神經(jīng)水腫的減少更快。MSCs給藥增加了MRI中的分?jǐn)?shù)各向異性（FA）值，證明了受損神經(jīng)中的軸突再生。聯(lián)合治療組在PNI后3、4和6周觀察到最高的FA值。從組織學(xué)評估來看，聯(lián)合治療（MSCs+EA）顯示出再生有髓纖維數(shù)量最多和近端髓鞘神經(jīng)纖維直徑最大。它改善了神經(jīng)纖維連續(xù)性的恢復(fù)。

脈沖磁場脈沖磁場（PMF）增強(qiáng)了MSCs在CCI模型大鼠中的治療效果。研究了MSCs治療（時間依賴性 - PNI后1天或1周；途徑依賴性 - 系統(tǒng)性或局部）的療效、PMF及其聯(lián)合治療。2×10^6 MSCs的系統(tǒng)性給藥和1×10^6直接在受損神經(jīng)附近的局部注射均緩解了熱痛覺過敏和機(jī)械痛覺過敏，表現(xiàn)為撤退潛伏期增加和平均閾值提高。與單獨使用MSCs相比，使用MSCs和PMF的聯(lián)合治療顯著增強(qiáng)了潛伏期和閾值。MSCs的治療效果不受給藥方法（IP與局部）或時間（通過IP在PNI后1天或1周）的顯著影響。此外，在神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)中沒有觀察到時間依賴性差異。只有IP給藥，而不是局部注射，的MSCs增強(qiáng)了抗炎細(xì)胞因子的表達(dá)，并抑制了促炎因子的表達(dá)。其他聯(lián)合治療粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF），屬于造血生長因子家族的蛋白質(zhì)，被認(rèn)為與造血前體細(xì)胞的存活、增殖和分化有關(guān)。一項研究表明G-CSF增強(qiáng)了移植MSCs對PNI的神經(jīng)保護(hù)效果。局部注射MSCs到神經(jīng)減輕了凋亡，增強(qiáng)了再髓鞘化，并改善了運動功能。G-CSF的IP給藥抑制了壓碎傷害介導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子，減少了凋亡，增加了神經(jīng)髓鞘化，并改善了功能恢復(fù)。在聯(lián)合治療組中，MSCs被輸送到受損神經(jīng)，隨后G-CSF被注射到腹腔內(nèi)，對周圍神經(jīng)再生產(chǎn)生了額外的有益效果。移植的MSCs中凋亡死亡的減少和炎癥反應(yīng)的抑制涉及協(xié)同效應(yīng)。發(fā)酵大豆提取物（納豆），作為一種傳統(tǒng)飲食食品，可以促進(jìn)循環(huán)中的纖溶活性，并通過抑制纖維蛋白沉積來抑制施萬細(xì)胞的凋亡。在周圍神經(jīng)擠壓傷的大鼠模型中，研究了間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）和納豆的協(xié)同效應(yīng)。MSCs、納豆或聯(lián)合療法的給藥改善了神經(jīng)再生。納豆減少了移植MSCs中的凋亡，并顯著增加了神經(jīng)絲早期再生標(biāo)志物和S-100晚期標(biāo)志物的表達(dá)，從而增強(qiáng)了MSC治療的有益效果。納豆還抑制了施萬細(xì)胞的凋亡并下調(diào)了神經(jīng)炎癥。與單獨使用MSCs或納豆治療相比，聯(lián)合療法產(chǎn)生了最顯著的益處。

3.3.2.生物材料：3D神經(jīng)支架3D支架，一種3D打印方法，用于設(shè)計、優(yōu)化和制造定制的神經(jīng)修復(fù)支架，以促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷（PNI）中的再生。定制支架從3D解剖結(jié)構(gòu)重建，提供軸突引導(dǎo)，有利于趨化功能。它為影響運動和感覺通路的復(fù)雜神經(jīng)損傷提供了解決方案，并增強(qiáng)了組織再生。在大鼠坐骨神經(jīng)橫斷模型中，使用無細(xì)胞或神經(jīng)祖細(xì)胞（NCSC）負(fù)載的3D神經(jīng)支架修復(fù)復(fù)雜的坐骨神經(jīng)間隙損傷。坐骨神經(jīng)修復(fù)后，NCSC負(fù)載的神經(jīng)支架緩解了神經(jīng)病理性疼痛，并增強(qiáng)了PNI后的運動功能恢復(fù)。NCSC負(fù)載的3D支架組顯著減少了同側(cè)后爪內(nèi)側(cè)掌面的機(jī)械和熱性痛覺過敏。在3D支架治療NCSC后，免疫熒光分析顯示星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的激活減少。

3.3.3.生物活性因子預(yù)處理Netrins是一類分泌蛋白，調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞的遷移和軸突引導(dǎo)，在神經(jīng)發(fā)育期間。用過度表達(dá)的Netrin-1修飾MSCs促進(jìn)了PNI大鼠模型的功能恢復(fù)。與MSC治療相比，用預(yù)修飾的MSCs治療在受傷后28天顯示出更多的施萬細(xì)胞。用Netrin-1預(yù)處理的MSCs給藥后，BDNF和NGF的表達(dá)增加，并改善了坐骨神經(jīng)損傷后的運動神經(jīng)傳導(dǎo)。神經(jīng)生長因子（NGF）是一種神經(jīng)營養(yǎng)因子和神經(jīng)肽，主要參與調(diào)節(jié)特定目標(biāo)神經(jīng)元的生長、維持、增殖和存活。Moattari等人報告說，NGF預(yù)處理的MSCs在大鼠坐骨神經(jīng)損傷后2周和8周增加了坐骨神經(jīng)功能指數(shù)（SFI），并縮短了熱水爪浸入測試的時間。用NGF-MSCs治療顯示出更好的電生理恢復(fù)，增加了幅度并減少了潛伏期。組織學(xué)評估還表明，在NGF-MSC組中，神經(jīng)纖維、血管的數(shù)量和血管面積的百分比有更顯著的增加。基本的人類成脂因子成纖維細(xì)胞生長因子1（FGF-1），它參與組織生長，通過提供額外的細(xì)胞生存信號來保護(hù)細(xì)胞免受壓力。FGF1-MSC治療在大鼠CCI神經(jīng)病理性疼痛模型中調(diào)節(jié)了凋亡和神經(jīng)炎癥。在CCI模型的PNI后，凋亡蛋白和炎癥標(biāo)志物增加，并在MSCs和FGF1-MSCs給藥后得到緩解。FGF1-MSCs的效果顯著高于MSCs。

3.3.4.電磁場預(yù)處理低頻脈沖電磁場（PEMF）預(yù)處理促進(jìn)了MSCs在坐骨神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生的治療效率。體外實驗中，低頻PEMF促進(jìn)了BMSCs的增殖和神經(jīng)元分化。與未經(jīng)預(yù)處理的BMSCs相比，低頻PEMF修飾的BMSCs增殖更快，并表達(dá)了更高水平的生長因子mRNA。注射低頻PEMF預(yù)處理的BMSCs增加了三叉神經(jīng)節(jié)中髓鞘軸突的數(shù)量、軸突密度和存活神經(jīng)元的數(shù)量，從而加速了神經(jīng)再生。

3.3.5.針對周圍神經(jīng)損傷引起的脊髓損傷PNI引起的病理癥狀，如感覺異常/過敏、對周圍神經(jīng)刺激的異常反應(yīng)和脊髓回路，與脊髓和DRG中的分子和形態(tài)變化有關(guān)，包括細(xì)胞凋亡、神經(jīng)退行性和小膠質(zhì)細(xì)胞激活。到目前為止，大多數(shù)干細(xì)胞治療研究集中在受損周圍神經(jīng)的功能恢復(fù)上，忽視了PNI引起的脊髓病理變化，特別是小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和招募以及與凋亡相關(guān)的神經(jīng)元死亡，這可能是臨床患者在PNI后即使在治療干預(yù)后仍遭受慢性病理性疼痛的原因之一。鑒于脊髓、DRG和周圍神經(jīng)在解剖上彼此接近，以及周圍和中樞神經(jīng)系統(tǒng)在功能上相連，針對PNI引起的脊髓損傷的治療策略可能會增強(qiáng)干細(xì)胞治療在PNI中的使用。在手術(shù)后第4天和第5天將1 10^6 BMSCs鞘內(nèi)注入脊髓，抑制了背角神經(jīng)元的退行性變，增強(qiáng)了神經(jīng)再生，并緩解了坐骨神經(jīng)損傷后的病理性疼痛。針對PNI引起的脊髓病理變化的周圍給藥2 10^6 NCSCs取得了有利的結(jié)果，緩解了神經(jīng)病理性疼痛并增強(qiáng)了運動性能。

4.結(jié)論和未來展望
由于其再生能力，干細(xì)胞治療已成為增強(qiáng)神經(jīng)疾病功能恢復(fù)的有希望的替代治療方法。本章總結(jié)的臨床前研究支持了干細(xì)胞治療在全球腦缺血引起的CA和PNI后神經(jīng)退行性變中的治療潛力。許多類型的干細(xì)胞可以用于干細(xì)胞治療，包括多能干細(xì)胞、NSCs、MSCs、臍帶血干細(xì)胞和其他細(xì)胞類型。不同類型干細(xì)胞的安全性、可靠性、最大效率和可能的副作用，如腫瘤形成，需要進(jìn)一步調(diào)查。最佳劑量、給藥時間、干細(xì)胞輸送方法以及細(xì)胞預(yù)處理和預(yù)條件以提高干細(xì)胞治療的效率需要進(jìn)一步研究。對于PNI，局部注射干細(xì)胞的一個潛在擔(dān)憂是程序的侵入性質(zhì)，這可能會降低臨床轉(zhuǎn)化。一項臨床研究將干細(xì)胞局部注射到臨床患者中。治療效果沒有報告炎癥、感染或出血。除了關(guān)注PNI引起的脊髓損傷外，其他可能產(chǎn)生類似治療效果的周圍給藥途徑或其他輸送策略，需要在未來的研究中驗證。衰老是干細(xì)胞治療的另一個重要問題。為了最小化由衰老引起的功能損失，至關(guān)重要的是要闡明如何快速準(zhǔn)確地檢測干細(xì)胞的衰老比例和程度。通過解決這些問題，干細(xì)胞治療最終可能成為神經(jīng)疾病的臨床可行和有效治療方法，并在未來提高患者的生活質(zhì)量。

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• 與E8體系對標(biāo)，細(xì)胞增殖與形態(tài)無差異
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