細胞氣液界面暴露方法的一個重要問題及CULTEX的解決方案

關于細胞氣液界暴露，由于歐盟關于化學物質(zhì)的毒性風險評估（REACH EC No. 1907/2006）法規(guī)的改變，以及目前不斷發(fā)展的替代方法的需求，以取代動物實驗為目標，在體外模型基礎上進行肺毒性的評估的技術，顯然是非常有必要的。迄今為止，國內(nèi)外的細胞體外毒性測試實驗研究中，仍多采用浸沒式細胞培養(yǎng)方法進行。然而，在浸沒條件下的顆粒物暴露并不符合在細胞體內(nèi)的真實情況，并可能影響研究受試物（顆粒物、氣體等）的物理化學性質(zhì)。早在1999年，德國Aufderheide教授便首先提出了細胞空氣-液體界技術，并隨后研制了專門的體外暴露設備的第一代Cultex細胞暴露系統(tǒng)，用于對體外肺細胞在空氣-液體界面直接進行各種受試物的暴露。這一系統(tǒng)符合細胞在空氣-液體界面進行顆粒暴露的所有要求，從而初步成功的建立了受試物急性肺毒性評價的體外模型。

肺細胞在氣-液界面暴露染毒技術模擬體內(nèi)真實條件的同時，發(fā)現(xiàn)該方法可能出現(xiàn)一個嚴重的問題：潔凈空氣對照組的細胞存活率，與培養(yǎng)箱內(nèi)細胞相比有明顯降低（僅為培養(yǎng)箱內(nèi)細胞存活率的40%~60%，如下圖1）。此問題的出現(xiàn)意味著，實驗組細胞損傷的原因更加復雜了，所獲得實驗數(shù)據(jù)的意義降低了。

      圖1                             圖2

為了完善體外細胞氣-液界面暴露方法，德國CULTEX® Laboratories實驗人員進行了大量改進性實驗，通過對CULTEX 暴露模塊結(jié)構(gòu)、細胞培養(yǎng)選材、氣路設計與氣流控制、實驗操作流程等多個方面（由于優(yōu)化方案中所用方法及數(shù)據(jù)全部是根據(jù)CULTEX RFS的尺寸及氣路設計進行大量實驗基礎上獲得的，所以此方案僅適用于CULTEX RFS系統(tǒng)）進行調(diào)整優(yōu)化處理：

實驗材料：人肺腺癌上皮細胞系A549（CCL-185, ATCC）被用于暴露實驗。A549細胞在Dulbecco’s Modified Eagle’s培養(yǎng)基生長（DMEM）（Biochrom, Germany）含10%胎牛血清（FCS Gold, PAA Laboratories, Germany）和1%青霉素/鏈霉素（Gibco Life Technologies, Germany）。

實驗中，A549細胞種在BD Falcon（PET膜，4.2 cm2, 孔徑 0.4 μm, 孔密度 2.0 ± 0.2 × 106, BD Falcon, Germany）或者Corning Transwell（PET 膜, 4.67 cm2, 孔徑 0.4 μm, 孔密度 4.0 × 106, Corning, Germany）細胞小室中，以密度1.2 × 105 cells/cm2，條件37 °C and 5% CO2 （標準條件）培養(yǎng)24h。

優(yōu)化方法：

1、    CULTEX RFS模塊主要結(jié)構(gòu)的優(yōu)化

1 CULTEX RFS模塊是細胞體外培養(yǎng)與暴露的核心結(jié)構(gòu)，與第一代的線性CLUTEX模塊相比，RFS模塊采用輻射流（Radial Flow System）結(jié)構(gòu)，此結(jié)構(gòu)不僅可以使顆粒物氣溶膠在細胞表面沉積更均勻，重復性更高。同時，該結(jié)構(gòu)在進氣流分配、過載氣流釋放、廢氣氣流排出上更加同步均一，便于統(tǒng)一控制氣流壓力；

2 系統(tǒng)優(yōu)化了過載氣體預排出通道的結(jié)構(gòu)設計，該設計把系統(tǒng)過載氣體排出對腔室內(nèi)壓力的影響降到最低，同時更可以把氣體中可能混合的雜質(zhì)一同排出，減少污染空氣對細胞影響； eq \o\ac(○,3)3 氣體噴嘴可替換，根據(jù)市售的不同品牌的tranwell小室，CULTEX對應開發(fā)了與之適用的氣體噴嘴，減少氣體因噴嘴與小室不適用而造成對細胞的壓力； eq \o\ac(○,4)4 RFS暴露的開啟和關閉，僅需要旋轉(zhuǎn)開閉旋鈕即可完成，不僅使系統(tǒng)的操作更簡單、快捷，更重要的是其氣密性更加完好，不會因操作漏氣而對細胞的意外影響。

2、 CULTEX RFS系統(tǒng)氣體流量控制設計優(yōu)化

CULTEX RFS系統(tǒng)的氣流控制是通過真空+質(zhì)量流量控制器進行的，1 CULTEX工程師們在對廢氣處理端加入兩個氣流緩沖結(jié)構(gòu)；2優(yōu)化出出最佳腔氣體流量；3 優(yōu)化出最佳通氣壓力。

3、 CULTEX RFS模塊操作流程優(yōu)化

1 優(yōu)化CULTEX RFS模塊的開啟和關閉的影響； eq \o\ac(○,2)2 膜底部的培養(yǎng)基是對細胞影響的最重要的因素，優(yōu)化出其液面高度； eq \o\ac(○,3)3 優(yōu)化模塊的清洗方法及高壓滅菌影響。經(jīng)過反復實驗后，CULTEX® Laboratories從以上三點進行了優(yōu)化并提供成熟的標準操作程序。

4、 細胞培養(yǎng)小室選擇

細胞培養(yǎng)小室是細胞生長，氣溶膠暴露的關鍵場所，CULTEX®Laboratories發(fā)現(xiàn)：實驗中隨著暴露時間的持續(xù)，雖然潔凈空氣暴露組內(nèi)細胞活性保持穩(wěn)定，但是在BD Falcon小室內(nèi)的細胞卻表現(xiàn)出形態(tài)學上的不規(guī)則，尤其是小室中央位置的細胞，在30分鐘的潔凈空氣暴露后更加明顯(下圖3 A)。為此，CULTEX®Laboratories尋找并研制了適合RFS使用的最佳的小室，在潔凈空氣暴露30分鐘后（下圖3），細胞呈均勻分布形態(tài)良好，同時細胞存活率沒有收到影響。

圖3

總之，CULTEX® Laboratories對Cultex RFS一系列優(yōu)化后的實驗結(jié)果表明，細胞體外暴露實驗中潔凈空氣對照組的細胞存活率的影響是存在的，但可以通過大量的優(yōu)化處理實驗加以降低。優(yōu)化了的Cultex RFS系統(tǒng)進行A549細胞對清潔空氣暴露方法的，也證明Cultex RFS技術是一種很好的替代學方法，是一個重要肺毒性細胞體外模型，對吸入毒理學的發(fā)展具有重要意義。

注：文中數(shù)據(jù)和資料均引自CULTEX® Laboratorie GmbH，關于CULTEX細胞體外暴露方法及優(yōu)化方案的更多資料和數(shù)據(jù)請咨詢德國CULTEX® Laboratorie或中國區(qū)技術服務中心北京佰樂良成科技公司。

最終使CULTEX RFS細胞暴露模塊內(nèi)的細胞存活率保持與培養(yǎng)箱內(nèi)對照組基本相同并十分穩(wěn)定（如上圖2）。