最新生物標(biāo)志物biomarker檢測(cè)技術(shù)進(jìn)展（二）

生物標(biāo)志物檢測(cè)的創(chuàng)始：免疫組織化學(xué)

人類(lèi)最早是在組織樣本中實(shí)現(xiàn)了生物標(biāo)志物的檢測(cè)。組織特異性的標(biāo)志物在現(xiàn)代醫(yī)療中被經(jīng)常用來(lái)研究腫瘤等疾病中的病理變化。最經(jīng)典的被轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)成功應(yīng)用于組織中標(biāo)志物檢測(cè)的方法是免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry），特別是在肺炎中的早期應(yīng)用。免疫組化技術(shù)在1940年代發(fā)明時(shí)^[1]，初衷是證實(shí)病原體的存在部位，例如肺炎球菌II型和III型多糖在鼠中的定位。過(guò)氧化物酶標(biāo)記技術(shù)在1979年成熟，免疫組化的靈敏度被顯著提高。帶來(lái)的直接益處是福爾馬林固定石蠟包埋（FFPE）組織切片的免疫組化檢測(cè)。多數(shù)情況下免疫組化使用酶聯(lián)抗體來(lái)進(jìn)行顯色反應(yīng)，并通過(guò)顯微鏡鏡檢。盡管在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中使用廣泛，但這項(xiàng)技術(shù)仍然存在瓶頸：需要非常專(zhuān)業(yè)的操作人員和極為嚴(yán)格的標(biāo)準(zhǔn)，還僅能得到半定量的結(jié)果。近些年來(lái)專(zhuān)家致力于免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化和自動(dòng)化。但要在全世界各地的實(shí)驗(yàn)室實(shí)現(xiàn)非常一致的免疫組化，并且在假陽(yáng)性或假陰性等區(qū)分度方面達(dá)到一致的判別標(biāo)準(zhǔn)，還面臨眾多的困難，爭(zhēng)論和挑戰(zhàn)。人們對(duì)免疫組化應(yīng)用于標(biāo)志物檢測(cè)的展望包括提高靈敏度以檢測(cè)低豐度蛋白，較好的動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍，更高的空間分辨率以判別標(biāo)志物表達(dá)的細(xì)胞類(lèi)型甚至是細(xì)胞器類(lèi)型。另外，免疫組化在多重性，絕對(duì)定量以及特異性方面的需求還沒(méi)有得到有效滿(mǎn)足。

生物標(biāo)志物的應(yīng)用關(guān)鍵：體液樣本檢測(cè)

生物標(biāo)志物近年來(lái)引起了極大的關(guān)注，因?yàn)橛写罅吭谘獫{或血清中的蛋白標(biāo)志物被鑒定。盡管這些蛋白有較高的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)價(jià)值，但現(xiàn)有技術(shù)的檢測(cè)靈敏度或檢測(cè)能力仍然是主要的制約因素。事實(shí)上在過(guò)去長(zhǎng)達(dá)15年時(shí)間里，平均每年進(jìn)入臨床應(yīng)用的新的生物標(biāo)志物僅為1-2個(gè)。在平臺(tái)的選擇方面，靈敏度并不是唯一的考量，準(zhǔn)確性，可重復(fù)性，動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍大小以及樣本通量決定標(biāo)志物檢測(cè)能力。由此也不難理解為什么質(zhì)譜技術(shù)在體液樣本檢測(cè)中的應(yīng)用不廣：質(zhì)譜最主要的缺陷是不適合復(fù)雜樣品的分析，特別是體液樣品，體液的樣本除了成分復(fù)雜，更有巨大的動(dòng)態(tài)范圍。

在血清和血漿這樣的生物樣本中檢測(cè)蛋白標(biāo)志物，動(dòng)態(tài)檢測(cè)范圍是區(qū)分度的關(guān)鍵。不僅個(gè)體間同一指標(biāo)可以出現(xiàn)幾十倍甚至上百倍的產(chǎn)別。同一份樣本里的不同標(biāo)志物更是可以達(dá)到10個(gè)數(shù)量級(jí)的差別。例如白蛋白含量大約在30-50mg/mL，而細(xì)胞因子可低至pg/mL. 而潛在的大量新型生物標(biāo)志物甚至?xí)�遠(yuǎn)低于已知標(biāo)志物的表達(dá)水平（新標(biāo)志物常表達(dá)量較低，因而未被傳統(tǒng)技術(shù)檢出）。血清和血漿樣本因其容易獲得性，一直被當(dāng)做最理想的生物標(biāo)志物樣本。但由于血液循環(huán)系統(tǒng)的稀釋作用，血液樣本中的蛋白標(biāo)志物通常含量極低，需要高靈敏度的技術(shù)才能有效檢測(cè)。

總體而言，對(duì)于體液樣本的檢測(cè)，人們需要較高的靈敏度來(lái)檢測(cè)表達(dá)含量很低的樣本。同時(shí)，盡可能擁有較寬的動(dòng)力學(xué)范圍來(lái)適應(yīng)樣本的濃度差異。盡管很多研究者可能認(rèn)為現(xiàn)有傳統(tǒng)技術(shù)已經(jīng)可以很方便地測(cè)定一些常規(guī)的生物標(biāo)志物，但事實(shí)上人們還是會(huì)經(jīng)常發(fā)現(xiàn)有重要的標(biāo)志物無(wú)法測(cè)得，并且根據(jù)數(shù)據(jù)結(jié)果較輕易相信樣本中不存在目標(biāo)分析物。在意識(shí)到現(xiàn)有技術(shù)其實(shí)不能充分檢測(cè)樣本中含量較低的分析物之前，重要生物學(xué)現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)機(jī)會(huì)就已經(jīng)錯(cuò)失了。關(guān)于這一點(diǎn)在后文的篇幅中將做簡(jiǎn)明扼要的討論。多重生物標(biāo)志物檢測(cè)（Multiplex）技術(shù)的興起和發(fā)展使得研究者更容易利用有限的樣本和經(jīng)費(fèi)做出科研發(fā)現(xiàn)，受到廣泛的歡迎。但不論哪種平臺(tái)，多重檢測(cè)與生俱來(lái)的檢測(cè)指標(biāo)間相互干擾的問(wèn)題很難避免，在涉及超高靈敏度檢測(cè)需求時(shí)這種干擾經(jīng)常大到無(wú)法被研究者忽視。這也解釋更前沿、對(duì)數(shù)據(jù)要求更高的工作，例如藥物研發(fā)，通常不把多重檢測(cè)技術(shù)當(dāng)成首選方案。

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