液相篩選原理及常用方法介紹
一．文庫液相篩選原理
該方法是采用液相介質。首先利用生物素標記的抗原在溶液中結合表面呈現(xiàn)功能抗體的重組噬菌體，再利用親和素偶聯(lián)的瓊脂糖或親和素偶聯(lián)的磁珠來捕獲與利用生物素標記的抗原結合的重組噬菌體，從而實現(xiàn)對抗體庫中功能抗體的富集；通過改變抗原濃度，結合-洗脫時間，能篩選得到高親和力的抗體；或選擇合理的篩選程序，如利用競爭二抗，去除無關噬菌體抗體，篩選針對特異表位的抗體。
二．液相篩選優(yōu)點
（1）篩選效率高，增加了噬菌體顆粒與抗原接觸的機會，能有效地將低拷貝數(shù)或低親和力的抗體從文庫中分離出來；
（2）解決了凝固后抗原表位被破壞的問題；
（3）可根據(jù)文庫容量、抗原相對分子質量和純度等靈活調整篩選系統(tǒng)；
（4）可在一定程度上預先確定所需的抗體親和力。可根據(jù)文庫容量、抗原相對分子質量和純度等靈活調整篩選系統(tǒng)；
（5）所需抗體的親和力可在一定程度上預先確定。
三．液相篩選優(yōu)劣勢對比
優(yōu)勢：
在液相中，抗原和噬菌體抗體都可以自由地運動，抗原與噬菌體抗體碰撞、繼而結合的概率將大大增加；其次，抗原可以保持其空間構象，并且噬菌體抗體可以結合抗原所有的表位，而在固相篩選中，抗原有可能因吸附在固相介質上而導致部分表位的丟失。
劣勢：
生物素化的過程可能會破壞抗原表位，導致抗原抗體結合位點的失活；固相上的鏈霉素容易引起非特異吸附等。
四．液相篩選常用方法
磁珠篩選：磁珠純化蛋白的原理是利用磁性珠子表面的親和基團與目標蛋白質之間的特異性結合，將目標蛋白質從混合物中分離出來。磁性珠子通常是由磁性材料和親和基團組成的，親和基團可以是金屬離子、抗體、酶、核酸等。當混合物中存在目標蛋白質時，磁性珠子上的親和基團與目標蛋白質結合，形成磁珠蛋白質復合物。然后，通過磁場的作用，將磁珠蛋白質復合物集中在一起，從而實現(xiàn)目標蛋白質的分離純化。
五．磁珠篩選步驟
使用Tris-HCl-Tween緩沖液（TBST）洗滌親和素標記的磁珠，用BSA封閉備用。
(1) 包被磁珠：用1nmol生物素化抗原和1nmol游離生物素分別與500µL封閉后的磁珠在室溫下孵育1小時。使用磁性架將磁珠吸附在上面，去除上清，再用TBST洗滌后重懸于含1%BSA的TBS中。
(2) 負向篩選：在生物素包被的磁珠中加入1mL擴增好的噬菌體抗體庫，在室溫下孵育1小時。再用磁性架吸附磁珠。
(3) 抗原篩選：就上述得到的上清移入生物素化的抗原磁珠中，在室溫下孵育1小時，再用磁性架吸附磁珠，去掉上清。TBST洗滌10次，去掉上清。
(4) 洗脫：加入250µL 10µg/mL胰蛋白酶，混勻30min。
(5) 取120µL洗脫的噬菌體加入到1.5mLTG1中，在37℃條件下水浴30min，離心后加200µL TES緩沖液，均勻涂布在TYE-A-G平板上，剩余的加甘油保存。
(6) 次級庫的制備：次日洗下菌苔接種于新鮮培養(yǎng)基中培養(yǎng)，向其中加入輔助噬菌體KM13，侵染30min后，重懸沉淀物，在37℃培養(yǎng)1h后加卡那霉素至終濃度為50µg/mL，30℃培養(yǎng)過夜，次日離心后，將上清倒至遇冷的PEG/NaCl中沉淀噬菌體，制備出次級庫。
六．蛋白偶聯(lián)步驟
計算需要偶聯(lián)的蛋白，抗體量一般每毫克活化的羧基磁珠可以偶聯(lián)20-500ug的蛋白（抗體）。可適量添加一些載體蛋白，如BSA Fraction V，增加反應體系中的總蛋白量，從而可以起到一定的封閉作用。保證抗體偶聯(lián)的正確方向。
(1) 將蛋白加至5mL MES緩沖液中，（吸取50μL蛋白液于950μL的MES緩沖中，配成1: 20的稀釋液標記為偶聯(lián)反應前蛋白液，置于一旁用于后面的偶聯(lián)率計算。
(2) 將剩下的蛋白液加到裝有活化磁珠的離心管內，劇烈振蕩混勻，室溫下，將離心管置于旋轉混勻儀上偶聯(lián)反應16-24小時。（將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心收集上清，標記為偶聯(lián)后蛋白液，用于計算偶聯(lián)率。
(3) 重懸磁珠于5mLMES緩沖液中，振蕩搖勻。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清。
(4) 重復步驟（3），重復加5mL的淬滅液，振蕩搖勻，室溫下，將離心管置于旋轉混勻儀上30分鐘。將離心管放在磁分離架上直到上清液變清后，用吸管小心移棄上清。
七．優(yōu)化液相篩選方案
可以將固定化金屬親和層析（IMAC）技術引入到噬菌體抗體庫的篩選中，將純化的帶有His標簽的抗原與噬菌體抗體庫混合，噬菌體抗體與抗原充分結合后再加入親和介質，使噬菌體抗體抗原復合物通過His標簽與介質結合，然后通過充分洗滌去除非特異性噬菌體抗體，最后將特異性噬菌體抗體解離下來，感染TG1，在進行下一輪篩選，是一種改進的液相篩選方法。
