Nucleofector 細(xì)胞核轉(zhuǎn)染技術(shù)原理、步驟及應(yīng)用

Amaxa®Nucleofector®技術(shù)是 Lonza(原Amaxa)公司的專利創(chuàng)新技術(shù)，它綜合應(yīng)用傳統(tǒng)的電穿孔技術(shù)及細(xì)胞特異性細(xì)胞核轉(zhuǎn)染液，通過調(diào)整優(yōu)化的電轉(zhuǎn)參數(shù)（內(nèi)存轉(zhuǎn)染程序），直接把外源基因?qū)�入原代�?xì)胞及細(xì)胞系的細(xì)胞漿和細(xì)胞核中。它不同于傳統(tǒng)的電穿孔儀，因?yàn)樗�可以把外源基因直接�?dǎo)入核中，而且細(xì)胞存活率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于電穿孔儀。

Nucleofector 技術(shù)是獨(dú)一無二的，因?yàn)樗�可以直接將DNA轉(zhuǎn)染到細(xì)胞核內(nèi)，因此實(shí)現(xiàn)了因受到細(xì)胞分裂限制而一直困擾人們的原代細(xì)胞的高效率轉(zhuǎn)染。在 Nucleofector核酸轉(zhuǎn)染儀的幫助下，您可以在腫瘤研究、免疫學(xué)、組織工程學(xué)及心血管疾病研究領(lǐng)域中輕而易舉地獲得大于90％的高效率基因轉(zhuǎn)染率。Nucleofector 核酸轉(zhuǎn)染技術(shù)特別適用于轉(zhuǎn)染原代細(xì)胞和難以轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，如T細(xì)胞及PC-12細(xì)胞系等。

Nucleofector試劑盒包含兩個(gè)溶液：Nucleofector溶液和添加劑。兩者都是針對(duì)每個(gè)細(xì)胞類型來特異開發(fā)的。它們?cè)诤宿D(zhuǎn)染過程中提供了細(xì)胞友好的環(huán)境，支持DNA直接到達(dá)細(xì)胞核。Nucleofector溶液只與Nucleofector裝置共同使用時(shí)，才能發(fā)揮作用。

在某些細(xì)胞中Nucleofector的轉(zhuǎn)染效率可以達(dá)到90%，與病毒感染同樣有效。Nucleofector直接將DNA運(yùn)送到細(xì)胞核中，因此，基因表達(dá)就可以立即開始，數(shù)小時(shí)內(nèi)就可以完成轉(zhuǎn)染和分析的全過程，對(duì)于細(xì)胞系來說2-6小時(shí)就可以分析，對(duì)于原代細(xì)胞則需要4-16小時(shí)。

Nucleofector 細(xì)胞核轉(zhuǎn)染技術(shù)操作步驟  
整個(gè)操作過程只需四步，非常簡(jiǎn)單、高效。 
第1步：處理細(xì)胞，精確計(jì)數(shù) 
第2步：混合DNA、轉(zhuǎn)染液，重懸細(xì)胞，加入轉(zhuǎn)染杯 
第3步：將轉(zhuǎn)染杯放入轉(zhuǎn)染儀，按鍵選擇相應(yīng)程序，按"start"鍵開始轉(zhuǎn)染，10秒鐘左右 
第4步：取出細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)

 

傳統(tǒng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法和電穿孔轉(zhuǎn)染技術(shù)不能有效的對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。由于Lonza的Amaxa Nucleofector®電轉(zhuǎn)儀采用的是專利的Nucleofector®技術(shù)，能夠?qū)⑼庠椿�因直接�?dǎo)入到細(xì)胞核中，克服了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和普通電穿孔必須依賴細(xì)胞分裂時(shí)才有可能使外源基因入核表達(dá)的缺陷。如果使用Nucleofector® 4D Y Unit電轉(zhuǎn)模塊，甚至可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行原位貼壁電轉(zhuǎn)，即使是轉(zhuǎn)染凍存的原代神經(jīng)元細(xì)胞也能夠達(dá)到和新鮮提取的神經(jīng)元一樣的效果。

現(xiàn)階段，糖尿病的研究模型主要有糖尿病鼠活體模型和細(xì)胞模型。細(xì)胞模型主要是從分子層面研究糖尿病的形成、發(fā)病、遺傳機(jī)制，爭(zhēng)取能夠通過分子手段治療糖尿病，尤其是治療具有家族遺傳性的糖尿病。在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)和生物學(xué)研究中，常用于糖尿病研究的細(xì)胞有THP-1，鼠原代CD4+T細(xì)胞、原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、小鼠胰島瘤細(xì)胞系（MIN6）、Hela細(xì)胞、冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（CASMCs）、HL60、人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系（ARPE-19）、人PBMCs細(xì)胞、RBL-2H3等細(xì)胞。在以細(xì)胞為模型的研究當(dāng)中，科研人員需要將感興趣的外源物質(zhì)（質(zhì)粒DNA、siRNA等）高效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，已達(dá)到對(duì)目的基因進(jìn)行干擾的目的；但上述提到的這些常用細(xì)胞都是非常難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，利用常規(guī)的轉(zhuǎn)染方法很難將外源基因高效地轉(zhuǎn)入細(xì)胞中，所以選擇一個(gè)合適的細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法對(duì)實(shí)驗(yàn)的順利開展就顯得至關(guān)重要了。在之前的糖尿病研究當(dāng)中，為了能夠?qū)��?xì)胞進(jìn)行高效率的轉(zhuǎn)染，很多科學(xué)家都選擇了Lonza核轉(zhuǎn)染技術(shù)作為細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法和手段，實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)染，并取得了滿意的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

 

1.Marina Cardellini等以冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（CASMCs）為模型，利用Lonza核轉(zhuǎn)染等技術(shù)，研究了Ⅱ型糖尿病患者的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊忠SirT1對(duì)TIMP3的表達(dá)調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在CASMCs中，抑制SirT1的活性會(huì)下調(diào)TIMP3的表達(dá)，同時(shí)SirT1的過表達(dá)會(huì)上調(diào)TIMP3的表達(dá)。

2.Serve Olieslagers以人單核細(xì)胞為模型，利用siRNA基因敲除技術(shù)（Lonza核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)），對(duì)SMAD2和SMAD3進(jìn)行敲除，電轉(zhuǎn)染后細(xì)胞成活率>90%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SMAD2和SMAD3不會(huì)對(duì)TGF-β1介導(dǎo)的單核細(xì)胞遷移能力產(chǎn)生影響。

3.Suseela Srinivasan等以小鼠原代CD4+T細(xì)胞為模型，利用Lonza核轉(zhuǎn)染（siRNA）等技術(shù)，研究S1P能否通過調(diào)節(jié)HIF1α I.1和CD69的表達(dá)從而降低I型糖尿病人CD4+T細(xì)胞的活性，進(jìn)而發(fā)掘S1P降低I糖尿病人并發(fā)炎癥的治療潛能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示S1P能夠顯著性的上調(diào)HIF1αI.1，從而使IFN-和CD69的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)行降低I型糖尿病人CD4+T細(xì)胞的活性，具有一定的潛在治療能力。

4.Tian等以小鼠原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞為模型，利用Lonza核轉(zhuǎn)染（轉(zhuǎn)染效率70%）等技術(shù)，研究Akt信號(hào)通路與GW1516的相互作用關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Akt活性的受抑制會(huì)降低GW1516在小鼠原代主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的活化作用。

5.Intza Garin等以Hela細(xì)胞為模型，利用Lonza核轉(zhuǎn)染技術(shù)，將2個(gè)重要的INF隱性突變基因轉(zhuǎn)入Hela細(xì)胞，研究突變基因?qū)σ葝u素的合成是否產(chǎn)生影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，和轉(zhuǎn)入正常INF基因的細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)入隱性突變基因的細(xì)胞中的胰島素含量分別減少了86%和79%。所以Intza Garin等認(rèn)為具有隱性突變的INF基因的個(gè)體會(huì)減少胰島素的合成，從而誘發(fā)新生兒短暫性糖尿病。

6.Niels Engberding[6]等以斯普拉格-杜勒鼠原代血管平滑肌細(xì)胞（VSMCs）為模型，利用腺病毒感染和Lonza核轉(zhuǎn)染技術(shù)（RNAi）分別對(duì)IGF1Rs進(jìn)行過表達(dá)和下調(diào)表達(dá)，研究IGF1Rs表達(dá)量變化對(duì)VSMCs的胰島素敏感性產(chǎn)生的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示IGF1Rs的過表達(dá)會(huì)降低胰島素介導(dǎo)的Akt磷酸化的水平；IGF1Rs的下調(diào)表達(dá)會(huì)增強(qiáng)胰島素介導(dǎo)的IRβ的磷酸化水平，會(huì)增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)葡萄糖的攝取能力。

7.Jamie Cantrell Stanford等以MIN6細(xì)胞系為模型，利用siRNA技術(shù)（Lonza核轉(zhuǎn)染系統(tǒng)）分別對(duì)神經(jīng)鞘氨醇激酶2（SphK2）和Sgpp1（S1P磷酸酶）進(jìn)行基因敲除，以此研究鞘氨醇激酶（S1P）對(duì)葡萄糖刺激的胰島素分泌過程的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明S1P在葡萄糖刺激的胰島素分泌過程起到非常關(guān)鍵的調(diào)控作用。