Countstar® FL在抗體親和力實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用

抗體是自然產(chǎn)生用于幫助免疫系統(tǒng)抵御細(xì)胞內(nèi)外侵害的免疫球蛋白。免疫熒光法測定細(xì)胞水平的抗體親和力大小是評價(jià)抗體效果非常重要的指標(biāo)，當(dāng)前主要的測定方法是利用流式細(xì)胞儀以實(shí)現(xiàn)相對定量。而Countstar^® FL可通過間接免疫熒光法檢測不同抗原抗體反應(yīng)呈現(xiàn)的平均熒光強(qiáng)度直接定量評價(jià)抗體親和力大小，同時(shí)也可檢測細(xì)胞濃度、活率。此外，可獲得細(xì)胞圖片，實(shí)驗(yàn)過程中實(shí)時(shí)拍攝明場和熒光圖像。Countstar^® FL為客戶在抗體藥物篩選中提供了快速、準(zhǔn)確、可靠的抗體親和力檢測方法。Countstar^® FL（圖1）是一個(gè)智能的、直觀的細(xì)胞分析儀器用于多種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，包括細(xì)胞轉(zhuǎn)染，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞表面標(biāo)志物，細(xì)胞活力，抗體親和力和細(xì)胞周期的評估。該系統(tǒng)提供了強(qiáng)大的熒光定量結(jié)果。易于使用的自動(dòng)化程序指導(dǎo)你完成從細(xì)胞圖像采集到數(shù)據(jù)分析的過程。

材料：

Countstar 產(chǎn)品:Countstar® FL細(xì)胞分析儀/Countstar®樣品板/0.2% 臺(tái)盼藍(lán)染色液 (CS0101001-50)

其他材料

CHO細(xì)胞系/DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基(Hyclone-SH30243.01)/胎牛血清(Hyclone-SH30084.03)/胰蛋白酶(Hyclone-SH30042.01)，其中，CHO細(xì)胞系穩(wěn)定表達(dá)X蛋白，用于評價(jià)原研藥和仿制藥的親和力

一抗：不同濃度梯度的002-BMK1,002-BMK2, AB1, AB2, AB3, AB4, AB5, AB6, AB7, AB8, AB9, PCSK-9。其中，002-BMK1,002-BMK2能特異性的與X蛋白結(jié)合（陽性抗體），PCSK-9是陰性對照抗體。

二抗：Alexa Fluor® 488 Goat anti-mouse IgG (Biolegend)，5µg/mL

軟件

GraphPad Prism5®

方法：

細(xì)胞培養(yǎng)條件

1. CHO細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中，組成為：500mLDMEM培養(yǎng)基，2 mM L-谷氨酰胺, 1.5 g/L 碳酸氫鈉和10% 胎牛血清。于37°C, 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時(shí)；

2. 消化收集細(xì)胞。

染色步驟

1. 使用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)測定細(xì)胞濃度；

2. 準(zhǔn)備3*10^5個(gè)細(xì)胞/每個(gè)反應(yīng)；

3. 細(xì)胞樣品于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL PBS重懸；

4. 輕輕混勻細(xì)胞樣品，于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL Cellstaining buffer重懸；

5. 在細(xì)胞樣品中加入不同濃度梯度的一抗，每種抗體最高濃度為10µg/mL，4倍梯度稀釋，最低濃度為0.01µg/mL；

6.  37℃下，避光孵育60分鐘；

7.  細(xì)胞樣品于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL PBS重懸；

8.  輕輕混勻細(xì)胞樣品，于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL Cellstaining buffer重懸；

9.  在每個(gè)反應(yīng)組內(nèi)加入5µg/mL二抗；

10. 常溫下，避光孵育30分鐘；

11. 細(xì)胞樣品于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL PBS重懸；

12. 輕輕混勻細(xì)胞樣品，于400g下離心3-5分鐘，去上清，用100µL Cellstaining buffer重懸；

13. 混勻樣品，加入20µL于細(xì)胞計(jì)數(shù)板中，上機(jī)檢測。

注：以上操作可使用EP管或96孔板。

圖像獲取及數(shù)據(jù)分析

1.選用“臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)”進(jìn)行細(xì)胞濃度和活率測定；

2.單熒光模塊的程序用于獲取FITC通道下Alexa Fluor® 488的圖像；

3.每個(gè)樣品采集1或3個(gè)視野（該實(shí)驗(yàn)檢測1個(gè)視野）；

4.檢測過程中直接呈現(xiàn)數(shù)據(jù)結(jié)果，圖像獲取和數(shù)據(jù)分析完成后，導(dǎo)出數(shù)據(jù)結(jié)果。抗體親和力檢測過程如圖2。

圖2.抗體親和力檢測過程 

不同抗體梯度稀釋添加劑量

選用96孔板測定不同抗體與CHO細(xì)胞反應(yīng)的劑量效應(yīng)實(shí)驗(yàn)，包括原研藥、抗體藥和陰性對照（圖3）。一抗?jié)舛劝凑障卤碇甘咎荻冉档?10µg/mL-0.01µg/mL)。 

圖3. 96孔板中抗體濃度. 每孔中有CHO細(xì)胞（30萬個(gè)），二抗(5µg/mL)及圖示一抗(0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10µg/mL).其他孔為空.

Countstar® FL系統(tǒng)圖像獲取

Countstar® FL內(nèi)置的抗體親和力檢測程序進(jìn)行明場，F(xiàn)ITC通道下Alexa Fluor® 488圖像的獲取。明場的圖像作為一個(gè)參考標(biāo)準(zhǔn)對熒光場的圖像進(jìn)行分割，進(jìn)而獲取熒光場的信號。不同濃度梯度AB4，最高濃度PCK9和002-BMK1樣本圖像結(jié)果如圖3所示。

圖4. 0.01, 0.039, 0.156, 0.625, 2.5, 10µg/ml AB4與CHO細(xì)胞反應(yīng)后的細(xì)胞圖像.

圖像顯示抗體濃度越高，熒光信號越強(qiáng). 002-BMK1抗體能特異性的與X蛋白結(jié)合，PCSK-9為陰性對照抗體. 圖像代表002-BMK1樣品有較強(qiáng)的熒光信號，PCSK-9樣品基本沒有熒光信號.

抗體親和力定量分析

不同抗原抗體反應(yīng)呈現(xiàn)的平均熒光強(qiáng)度直接定量評價(jià)抗體親和力大小。穩(wěn)定表達(dá)X蛋白的CHO細(xì)胞系應(yīng)用于分析抗體親和力，Countstar®FL可直接顯示測試結(jié)果，并將數(shù)據(jù)導(dǎo)出進(jìn)行分析。使用GraphPad Prism5®對抗體的EC50進(jìn)行分析(Fig. 5A)。測試結(jié)果顯示樣品熒光強(qiáng)度隨著一抗?jié)舛壬�高而增加，平均熒光�?qiáng)度曲線代表不同濃度下每個(gè)抗體的反應(yīng)活性，其中PCSK-9為陰性對照抗體，樣品基本沒有熒光信號。各抗體的LogEC50結(jié)果顯示原研藥的抗體親和力比仿制藥更好，而仿制藥中AB2, AB3, AB4, AB6效果較好，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)(Fig. 5B)。Countstar® FL系統(tǒng)為評價(jià)抗體親和力提供直接可靠的結(jié)果。                                                   

圖5. 抗體親和力定量分析結(jié)果. A.不同濃度梯度抗體下不同抗原抗體反應(yīng)中平均熒光強(qiáng)度.B.原研藥和仿制藥的分析結(jié)果比較.

總結(jié)：

Countstar^® FL系統(tǒng)提供了一個(gè)快速，直接，容易的方法評價(jià)抗體親和力。此外，它是融合了電子顯微鏡，圖像處理，自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)于一體的設(shè)備。另外，Countstar^®  FL提供擴(kuò)展功能，用戶可以根據(jù)自身需要進(jìn)行定制。Countstar^® FL是一款高度可移動(dòng)的設(shè)備，內(nèi)置多種預(yù)設(shè)程序，便于用戶快速獲取準(zhǔn)確，穩(wěn)定，可高度重現(xiàn)的數(shù)據(jù)。儀器中每個(gè)應(yīng)用模塊簡單易用，大大簡化了常規(guī)實(shí)驗(yàn)室的工作，給客戶提供高質(zhì)量的科研數(shù)據(jù)。Countstar^® FL為客戶開展抗體親和力實(shí)驗(yàn)提供一個(gè)直接可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。