微生物新手培訓(xùn)教材—菌落總數(shù)

1、菌落總數(shù)所使用標(biāo)準(zhǔn)

食品企業(yè)一般會(huì)用到的兩個(gè)做菌落總數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)。（當(dāng)然還有其他標(biāo)準(zhǔn)）

食品國家標(biāo)準(zhǔn)：

GB 4789.2-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》

生產(chǎn)用水：

GB-T5750.12-2006 《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法微生物指標(biāo)》

以這兩個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來說，它們的檢測(cè)方法是差不多，主要區(qū)別在于培養(yǎng)基的不同和樣品的狀態(tài)不同（食品中有固態(tài)和液態(tài)，生活飲用水只有液態(tài)）。食品的培養(yǎng)基是使用PCA，生產(chǎn)用水的使用NA。

2、培養(yǎng)基成分

PCA（平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基）

胰蛋白胨      5.0g

酵母浸膏      2.5g

葡萄糖         1.0g

瓊脂           15.0g

蒸餾水        1000mL

注：胰蛋白胨提供碳源和氮源；酵母浸粉提供B族維生素；葡萄糖提供能源；瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

NA（營養(yǎng)瓊脂）

蛋白胨        10g

牛肉膏        3g

氯化鈉        5g

瓊脂          14g（標(biāo)準(zhǔn)10g-20g）

蒸餾水        1000mL

注：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、維生素、氨基酸和碳源;氯化鈉能維持均衡的滲透壓;瓊脂是培養(yǎng)基的凝固劑。

3、檢測(cè)方法

4、操作注意細(xì)節(jié)

1 菌落總數(shù)是比較常規(guī)的微生物檢測(cè)項(xiàng)目，也是比較容易做的一個(gè)微生物檢測(cè)方法，主要注意無菌操作，與稀釋液均勻性。

2 在空白出現(xiàn)菌落的時(shí)候需要去分析哪一步出現(xiàn)問題，人機(jī)料法環(huán)。當(dāng)然空白出現(xiàn)菌落的時(shí)候，那么該批次的菌落總數(shù)數(shù)據(jù)都作廢處理。在制樣和做樣的時(shí)候需要在百級(jí)的環(huán)境（百級(jí)的潔凈工作臺(tái)）下進(jìn)行。

3 稀釋液的均勻性，這個(gè)會(huì)影響結(jié)果，剛開始的時(shí)候可能會(huì)造成同一梯度的兩個(gè)結(jié)果相差有點(diǎn)遠(yuǎn)，這個(gè)是因?yàn)樽龅臅r(shí)候沒有把稀釋液均勻。如果前后兩個(gè)梯度沒有梯度性，那么就是在做稀釋做不好。這個(gè)都是靠多做，技術(shù)才會(huì)提高。（當(dāng)然還有一種情況，樣品是中添加了抑菌物質(zhì)，這樣沒有梯度性。）

5、計(jì)數(shù)

1  可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器Galaxy330，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位(colony-formingunits , CFU )表示。

菌落計(jì)數(shù)器Galaxy330/Galaxy331，詳細(xì)點(diǎn)擊：http://www.rocan17.com/product.asp?sid=196

2  選取菌落數(shù)在 30CFU~300CFU 之間、無蔓延菌落生長的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于 30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于 300CFU 的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。

3  其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。（這個(gè)是很多新手會(huì)問的一個(gè)問題）

4  當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無明顯界線的鏈狀生長時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。

計(jì)數(shù)（標(biāo)準(zhǔn)中介紹）

1  若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)，計(jì)算兩個(gè)平板菌落數(shù)的平均值，再將平均值乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)，作為每 g ( mL )樣品中菌落總數(shù)結(jié)果。

2  若有兩個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)在適宜計(jì)數(shù)范圍內(nèi)時(shí)，按式( 1 )計(jì)算:

3  若所有稀釋度的平板上菌落數(shù)均大于 300CFU，則對(duì)稀釋度最高的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)，其他平板可記錄為多不可計(jì)，結(jié)果按平均菌落數(shù)乘以最高稀釋倍數(shù)計(jì)算。

4  若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于 30CFU，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

5  若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長，則以小于 1 乘以最低稀釋倍數(shù)計(jì)算。

6  若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在 30CFU~300CFU 之間，其中一部分小于 30CFU 或大于300CFU 時(shí)，則以最接近 30CFU 或 300CFU 的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)計(jì)算。

6、菌落總數(shù)的問題（是一些新手問的問題）

1.有新人可能會(huì)拿著菌落總數(shù)的平板去問別人這是什么菌？

答：這是看不出來的，菌落總數(shù)只能檢測(cè)出樣品衛(wèi)生情況，一個(gè)樣品的細(xì)菌數(shù)量，不能驗(yàn)證出什么菌。這是一個(gè)不應(yīng)該犯的誤區(qū)。

2.若所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在 30CFU~300CFU 之間,其中一部分小于 30CFU 或大于300CFU 時(shí)。就會(huì)有人不知道怎么去判定那個(gè)梯度更接近30-300。

舉例：一個(gè)梯度：28/28；另梯度：305/305，那么那個(gè)數(shù)據(jù)更接近呢？

兩個(gè)方法（網(wǎng)友提供）：

a、按標(biāo)準(zhǔn)字面意思直接做差比較后再乘以稀釋倍數(shù)：28-30=-2，他們相差2；305-300=5，他們相差5。2比5要小，那么采取28相應(yīng)的梯度再乘以稀釋倍數(shù)；

b、恢復(fù)為同稀釋度做差比較：把兩個(gè)梯度換算成同一個(gè)梯度，一般把28換算成280。280-300=-20，相差20；305-300=5，相差5。20比5要大，那么采取305相應(yīng)的梯度。

（個(gè)人意見：我是更偏向于第二種，因?yàn)橐�在同一個(gè)梯度上做比較才能體現(xiàn)出數(shù)據(jù)的可靠性，同時(shí)我偏向采用前一個(gè)梯度的數(shù)字，那么這個(gè)數(shù)值可以減少一步步驟帶來的誤差，數(shù)據(jù)可能更加接近樣品的情況）

3.有時(shí)候會(huì)出現(xiàn)這么一個(gè)情況，最低稀釋梯度中一個(gè)平板出現(xiàn)1個(gè)菌落，另一個(gè)無菌落生長。那么結(jié)果怎么出呢？

答：（以固態(tài)為例子）在過去也有討論過，有人認(rèn)為報(bào)告寫5，也有認(rèn)為報(bào)告寫＜10（比較兩個(gè)平板均無菌落生長的時(shí)候報(bào)＜10）這個(gè)兩個(gè)報(bào)告方法其實(shí)也是可以采用。（我是采用第一種；個(gè)人理解不長報(bào)告＜10，那么長了也報(bào)＜10嗎？不太合理）

4.在做菌落總數(shù)的時(shí)候，有時(shí)候會(huì)樣品和菌落分不清的（老前輩不會(huì)這樣），那么如何區(qū)分兩種物質(zhì)呢？

答：在培養(yǎng)基中添加TTC（一般2%濃度1mL加到400mL的培養(yǎng)基中，TTC的濃度不要過高，會(huì)有抑制作用）。TTC的原理：TTC和活細(xì)胞線粒體內(nèi)的琥珀酸脫氫酶反應(yīng)，生成紅色的甲月贊。那么生長的菌落會(huì)變成紅色，這樣就可以區(qū)分菌落與樣品。

還有一個(gè)方法：4℃冷藏保存一個(gè)樣品和培養(yǎng)基混勻的平板做對(duì)照，觀察菌落的形態(tài)特征，老前輩們基本靠這個(gè)去區(qū)分的。

5、菌落總數(shù)計(jì)數(shù)包括霉菌嗎？

答：菌落總數(shù)的概念是這么規(guī)定的，食品檢樣經(jīng)過處理，在一定條件下（如培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間等）培養(yǎng)后，所得每g（mL）檢樣中形成的微生物菌落總數(shù)。所以也包括在PCA上生長的霉菌和酵母等微生物。

6、培養(yǎng)基溫度不好控制？

答：前提是培養(yǎng)基滅菌好了放在水浴鍋內(nèi)保溫46攝氏度。使用時(shí)一個(gè)同事在外面把培養(yǎng)基從水浴鍋拿到傳遞窗，培養(yǎng)基表面噴酒精殺菌，然后開啟傳遞窗的紫外燈5min（這一步是對(duì)培養(yǎng)基表面殺菌，減少對(duì)潔凈房的污染）。里面的同事5min之后拿起來放在手心人體不覺燙手，這樣的溫度最佳倒平板。（注意：倒平板的速度要快，一次最好只拿一瓶，避免培養(yǎng)基凝固）

7、有些朋友不理解菌落總數(shù)的單位CFU的意思。

答：CFU為Colony-Forming Units英文縮寫，其含義是形成菌落的菌落個(gè)數(shù)，不等于細(xì)菌個(gè)數(shù)。（比如兩個(gè)相同的細(xì)菌靠得很近或貼在一起，那么經(jīng)過培養(yǎng)這兩個(gè)細(xì)菌將會(huì)形成一個(gè)菌落，此時(shí)就是2個(gè)細(xì)菌，1CFU）。菌落總數(shù)往往采用的是平板計(jì)數(shù)法，經(jīng)過培養(yǎng)后我們數(shù)出平板上所生長出的菌落個(gè)數(shù)，從而計(jì)算出每毫升或每克待檢樣品中可以培養(yǎng)出多少個(gè)菌落，于是以CFU/ml或CFU/g報(bào)告之。

8、菌落超標(biāo)的危害。

答：食品的菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)，說明其產(chǎn)品的衛(wèi)生狀況達(dá)不到基本的衛(wèi)生要求，將會(huì)破壞食品的營養(yǎng)成分，加速食品的腐敗變質(zhì)，使食品失去食用價(jià)值。消費(fèi)者食用微生物超標(biāo)嚴(yán)重的食品，很容易患痢疾等腸道疾病，可能引起嘔吐、腹瀉等癥狀，危害人體健康安全。

但需要強(qiáng)調(diào)的是，菌落總數(shù)和致病菌有本質(zhì)區(qū)別，菌落總數(shù)包括致病菌和有益菌，對(duì)人體有損害的主要是其中的致病菌，這些病菌會(huì)破壞腸道里正常的菌落環(huán)境，一部分可能在腸道被殺滅，一部分會(huì)留在身體里引起腹瀉、損傷肝臟等身體器官，而有益菌包括酸奶中常被提起的乳酸菌等。但菌落總數(shù)超標(biāo)也意味著致病菌超標(biāo)的機(jī)會(huì)增大，增加危害人體健康的幾率。

9、培養(yǎng)后的培養(yǎng)基出現(xiàn)干裂情況。

答：干裂是由于培養(yǎng)基里面的水份缺失導(dǎo)致，所以當(dāng)出現(xiàn)干裂情況，先要觀察干裂平板的數(shù)量和位置�？词欠袷桥囵B(yǎng)箱內(nèi)部溫度不穩(wěn)定導(dǎo)致（一般平皿一疊可以放置六個(gè)，同時(shí)要注意每疊之間需要保留一點(diǎn)間隙讓其通風(fēng)）；排除儀器的原因之后，看是培養(yǎng)基否倒得太�。ǔ鯇W(xué)者可以拿三角瓶裝水進(jìn)行練習(xí)）；還有其他原因，其實(shí)在出現(xiàn)干裂的情況下，結(jié)果是無效的（除非干裂情況不嚴(yán)重）。排查出問題所在，可以避免我們下次再犯錯(cuò)。

10、培養(yǎng)基的配置。

答：培養(yǎng)基的包裝上（標(biāo)準(zhǔn)上）都會(huì)寫著先煮熱溶解再分裝，那么是不是一定要煮熱溶解呢？首先瓶子上的配置方法是直接配置一升的PCA，這里是必須要煮熱溶解（防止不均勻，使得部分培養(yǎng)基不凝固）。

其實(shí)配置培養(yǎng)基有兩個(gè)方法：第一個(gè)：用一個(gè)大容器配置培養(yǎng)基，然后加水煮熱溶解（注意攪拌，防止燒焦），待溶解完成之后進(jìn)行分裝（這里需要注意安全），再去滅菌。第二個(gè)方法就是使用500mL三角瓶（其他容器也可以）配置300ml的培養(yǎng)基，加水稍微溶解（此步不需要加熱），再拿去滅菌。