探討---在穩(wěn)定株篩選過程中，如何提高單克隆細(xì)胞的活性

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最近，單抗市場(chǎng)又迎來了一個(gè)關(guān)注的熱潮。實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員以及各大設(shè)備廠家，也都逐漸把目光和精力都投向了如何提高單抗藥物研發(fā)和生產(chǎn)的效率問題上了。在這一層面，各大單抗研發(fā)生產(chǎn)企業(yè)似乎都在進(jìn)行賽跑。誰在整個(gè)流程中領(lǐng)先一小步，那么極有可能在整個(gè)單抗藥物市場(chǎng)中贏得先機(jī)。

在這里，今天我們要討論的是關(guān)于在穩(wěn)定株篩選過程中，如何提高單克隆細(xì)胞的活性。大家都想把高產(chǎn)的細(xì)胞株順利地挑選出來，然后讓其穩(wěn)定地生長、增殖。真正做實(shí)驗(yàn)的人員才會(huì)發(fā)現(xiàn)，其實(shí)這整個(gè)過程遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有流程設(shè)計(jì)時(shí)那么簡單。這里會(huì)涉及到一下幾個(gè)問題：

其一，挑選的方法。目前，實(shí)驗(yàn)室里經(jīng)常用到的單克隆細(xì)胞篩選方法有有限稀釋法，半固體培養(yǎng)基挑選法（例如Clonpix），以及流式細(xì)胞術(shù)挑選法等。這其中有好多需要關(guān)注的點(diǎn)，例如挑選細(xì)胞的參數(shù)，挑選方法本身對(duì)細(xì)胞的損傷等。所以說，一個(gè)高效的篩選方法絕對(duì)能讓工作效率提高好幾倍。

有限稀釋法是目前最常用的一種常規(guī)武器，這種方法篩選細(xì)胞最大的好處就是基本上不會(huì)傷害細(xì)胞。整個(gè)過程中細(xì)胞所經(jīng)歷的，也僅僅是在移液槍頭中的短暫停留，因此幾乎是零損傷。不過，這種方法的弊端也是顯而易見，就是效率問題。首先是鋪板效率，雖然不到一分鐘能將一塊96孔板鋪滿，但是一般來說96孔中有細(xì)胞的概率在2/3左右（按照細(xì)胞濃度會(huì)有所差別），其中單個(gè)細(xì)胞的概率就更小了。這些細(xì)胞要經(jīng)過一段時(shí)間的生長，抗體分泌之后，在其上清液中去檢測(cè)抗體含量。流程耗時(shí)太長，且效率低下。但是在沒有更先進(jìn)的設(shè)備的時(shí)候，這還是目前最好的選擇。

半固體培養(yǎng)基挑選法。在半固體的培養(yǎng)基上，以一定的密度“種上”細(xì)胞，并且讓細(xì)胞生長并分泌抗體。經(jīng)過一段時(shí)間之后，原先細(xì)胞的周圍會(huì)有抗體產(chǎn)生，然后對(duì)整個(gè)體系進(jìn)行熒光抗體染色，并且通過熒光顯微設(shè)備檢測(cè)到熒光最強(qiáng)的“一團(tuán)”，將其“挖”出。接著，經(jīng)過一些特定的處理環(huán)節(jié)，將細(xì)胞置于懸浮培養(yǎng)環(huán)境中，讓其生產(chǎn)抗體。這是前幾年最流行的挑選方法，優(yōu)勢(shì)非常明顯，能看到單克隆細(xì)胞，又能檢測(cè)生產(chǎn)的抗體產(chǎn)量。但是后來很多使用者發(fā)現(xiàn)，剛從半固體培養(yǎng)基“挖”出來的細(xì)胞，不適合直接培養(yǎng)生產(chǎn)抗體，而是需要在養(yǎng)兩周以上進(jìn)行“排毒”。因?yàn)橹�前所用的熒光抗體，對(duì)細(xì)胞還是有一定的毒性。另外，很多用戶發(fā)現(xiàn)，由于生長環(huán)境的不同，原先在半固體培養(yǎng)基上挑選得到的高產(chǎn)細(xì)胞，在后續(xù)懸浮的培養(yǎng)環(huán)境中并不高產(chǎn)。

流式細(xì)胞術(shù)挑選法。流式細(xì)胞分選儀是挑選細(xì)胞的不二法寶，在細(xì)胞分析分選當(dāng)中占有重要一席。在很多抗體研發(fā)企業(yè)中，也都有用到流式細(xì)胞儀來挑選高產(chǎn)細(xì)胞株。的確，流式細(xì)胞儀在這一應(yīng)用領(lǐng)域有其獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，例如分析精確（挑選高產(chǎn)細(xì)胞），分選快速（每秒上萬個(gè)細(xì)胞）。不過，很多用戶發(fā)現(xiàn)雖然流式在這方面挑選效率很高，但是分下來的細(xì)胞活性卻很低。這和流式細(xì)胞術(shù)的原理有著極大地關(guān)系。流式細(xì)胞儀在分選過程中，整個(gè)內(nèi)部體系的壓力很大，一般有2~3個(gè)大氣壓強(qiáng)，細(xì)胞在這樣的環(huán)境中容易損傷。高頻震蕩出細(xì)小液滴的過程對(duì)細(xì)胞也是一種傷害。最后是1nl左右的液滴高速打到板子中的過程，對(duì)細(xì)胞是個(gè)不小的碰撞。

其二，細(xì)胞狀態(tài)。挑選的過程對(duì)細(xì)胞會(huì)有所傷害，但是細(xì)胞本身的狀態(tài)對(duì)篩選之后的細(xì)胞生長和增殖也是至關(guān)重要。細(xì)胞在篩選前已經(jīng)處于活性較差的狀態(tài)，在分離成單細(xì)胞之后，更不能奢望它能有所改觀。另外，傳代次數(shù)越多，一般單細(xì)胞在生長的概率越小。所以，有時(shí)候我們?cè)趯ふ一蛘弑容^篩選方法的時(shí)候，細(xì)胞的狀態(tài)也需要考慮進(jìn)去。

其三，培養(yǎng)基的選擇。動(dòng)物細(xì)胞本身都是“群居”的，單個(gè)生長本身就有很大的難度。細(xì)胞在生長過程中會(huì)分泌很多復(fù)雜的生長因子。這些生長因子會(huì)促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖，但是單個(gè)細(xì)胞生長時(shí)，這種促進(jìn)作用幾乎沒有了。很多細(xì)胞其實(shí)在分離出來的時(shí)候，明明有著很好的活性，但是卻偏偏不增殖。這類細(xì)胞它會(huì)在體積上慢慢變大，長大到一定程度直接就“自爆”了。因此，一個(gè)好的condition media,就會(huì)成為每家培養(yǎng)單細(xì)胞的秘密武器。

Namocell致力于單細(xì)胞的分離分選。獨(dú)創(chuàng)的微流體單細(xì)胞分離技術(shù)在抗體研發(fā)中有著很好的應(yīng)用。首先，Namocell單細(xì)胞分離儀的內(nèi)部壓力只有不到2 psi，整個(gè)分選過程無需高頻震蕩，保證了細(xì)胞活性；其次，用到激光激發(fā)和熒光接收的原理，能夠?qū)��?xì)胞進(jìn)行識(shí)別和篩選；最后，不到1min即可分選一塊96孔板，分選速度快。