微生物菌種保藏方法

    微生物在使用和傳代過(guò)程中容易發(fā)生污染、變異甚至死亡，因而常常造成菌種的衰退，并有可能使優(yōu)良菌種丟失。菌種保藏的重要意義就在于盡可能保持其原有性狀和活力的穩(wěn)定，確保菌種不死亡、不變異、不被污染，以達(dá)到便于研究、交換和使用等諸方面的需要。菌種保藏的方法有哪些呢?

傳代保存法

　　有些微生物當(dāng)遇到冷凍或干燥等處理時(shí)，會(huì)很快死亡，因此在這種情況下，只能求助于傳代培養(yǎng)保存法。傳代培養(yǎng)就是要定期地進(jìn)行菌種轉(zhuǎn)接、培養(yǎng)后再保存，它是最基本的微生物保存法，例如酸奶等常用生產(chǎn)菌種的保存。

　　傳代保存時(shí)，培養(yǎng)基的濃度不宜過(guò)高，營(yíng)養(yǎng)成分不宜過(guò)于豐富，尤其是碳水化合物的濃度應(yīng)在可能的范圍內(nèi)盡量降低。培養(yǎng)溫度通常以稍低于最適生長(zhǎng)溫度為好。若為產(chǎn)酸菌種，則應(yīng)在培養(yǎng)基中添加少量碳酸鈣。

　　一般地，大多數(shù)菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進(jìn)行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。

　　傳代培養(yǎng)保存法雖然簡(jiǎn)便，但其缺點(diǎn)也很明顯，如：①菌種管棉塞經(jīng)常容易發(fā)霉;②菌株的遺傳性狀容易發(fā)生變異;③反復(fù)傳代時(shí)，菌株的病原性、形成生理活性物質(zhì)的能力以及形成孢子的能力等均有降低;④需要定期轉(zhuǎn)種，工作量大;⑤雜菌的污染機(jī)會(huì)較多。

液體石蠟覆蓋保存法

　　該法較前一種方法保存菌種的時(shí)間更長(zhǎng)，適用于霉菌、酵母菌、放線菌及需氧細(xì)菌等的保存。此法可防止干燥，并通過(guò)限制氧的供給而達(dá)到削弱微生物代謝作用的目的。其具有方法簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也適用于不宜冷凍干燥的微生物(如產(chǎn)孢能力低的絲狀菌)的保存，而某些細(xì)菌如固氮菌、乳酸桿菌、明串珠菌、分枝桿菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷霉菌、小克銀漢霉、毛霉、根霉等不宜采用此法進(jìn)行保存。

懸液保存法

　　即使微生物混懸于適當(dāng)溶液中進(jìn)行保存的方法。常用的有：

　�、� 蒸餾水保存法：適用于霉菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮于蒸餾水中即可在室溫下保存數(shù)年。本法應(yīng)注意避免水分的蒸發(fā)。

　�、� 糖液保存法：適用于酵母菌，如將其菌體懸浮于10%的蔗糖溶液中，然后于冷暗處保存，可長(zhǎng)達(dá)10年。除此之外，也可使用緩沖液或食鹽水等進(jìn)行保存。

載體保存法

　　將微生物吸附在適當(dāng)載體上進(jìn)行干燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種：

①土壤保存法

　　主要用于能形成孢子或孢囊的微生物菌種的保藏。方法是在滅菌的土壤中加入菌液，立即在室溫下進(jìn)行干燥或使菌體繁殖后再干燥，然后冷藏或在室溫下密封保存。保存用的土壤原則上以肥沃的耕土為宜，土壤需風(fēng)干、粉碎、過(guò)篩和滅菌。

　　使微生物在土壤中繁殖后進(jìn)行干燥保存的方法是：取適量土壤(5克)置于塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養(yǎng)基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜)，然后高壓滅菌。再將需保存的微生物進(jìn)行大量接種，培養(yǎng)至菌絲能用肉眼確認(rèn)的程度為止，移入干燥器中經(jīng)短時(shí)間干燥或風(fēng)干后密封，冷藏或室溫保存。

②砂土保存法

　　取清潔的砂，過(guò)60目篩去掉大砂粒，并用磁鐵吸去砂中鐵屑，再用NaOH溶液、10% HCl溶液和水交替清洗數(shù)次，干燥后，置于試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經(jīng)干熱滅菌后，加入1ml菌種培養(yǎng)液，經(jīng)充分混勻后，放入真空干燥器中，完全干燥后熔封保存。也可用二份洗凈的砂(經(jīng)HCl預(yù)處理)和一份貧瘠、過(guò)篩的黃土攙和后滅菌，再進(jìn)行菌種保藏。

③硅膠保存法

　　以6～16目的無(wú)色硅膠代替砂子，干熱滅菌后，加入菌液。加菌液時(shí)，由于硅膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設(shè)法加以冷卻。

④磁珠保存法

　　將菌液浸入素?zé)�磁�?或多孔玻璃珠)后再進(jìn)行干燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的硅膠(或無(wú)水CaSO4)，上鋪玻璃棉，再放上10～20粒磁珠，經(jīng)干熱滅菌后，接入菌懸液，最后冷藏、室溫保藏或減壓干燥后密封保藏。本法對(duì)酵母菌很有效，特別適用于根瘤菌，可保存長(zhǎng)達(dá)兩年半時(shí)間。

⑤麩皮保存法

　　在麩皮內(nèi)加入60%的水，經(jīng)滅菌后接種培養(yǎng)，最后干燥保藏。

⑥紙片(濾紙)保存法

　　將滅菌紙片浸入培養(yǎng)液或菌懸液中，常壓或減壓干燥后，置于裝有干燥劑的容器內(nèi)進(jìn)行保存。

寄主保存法

　　微生物侵入其寄主后加以保存的方法。

冷凍保存法

　　適用于抗凍力強(qiáng)的微生物。這些微生物可在其菌體細(xì)胞外遭受凍結(jié)的情況下而不受損傷，而對(duì)其它大多數(shù)微生物而言，無(wú)論在細(xì)胞外凍結(jié)還是在細(xì)胞內(nèi)凍結(jié)，都會(huì)對(duì)菌體造成損傷，因此當(dāng)采用這種保藏方法時(shí)，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：

　　① 要選擇適于冷凍干燥的菌齡細(xì)胞;

　�、� 要選擇適宜的培養(yǎng)基，因?yàn)槟承┪⑸�物�?duì)冷凍的抵抗力，常隨培養(yǎng)基成分的變化而顯示出巨大差異;

　　③ 要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長(zhǎng);

　�、� 最好在菌液內(nèi)不添加電解質(zhì)(如食鹽等);

　�、� 可在菌液內(nèi)添加甘油等保護(hù)劑，以防止在冷凍過(guò)程中出現(xiàn)菌體大量死亡的現(xiàn)象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護(hù)效果的溶劑，但對(duì)有些微生物而言，不加保護(hù)劑時(shí)更有效。

　　⑥ 原則上應(yīng)盡快進(jìn)行冷凍處理，但當(dāng)加入保護(hù)劑時(shí)，可靜置一段時(shí)間后再進(jìn)行處理。

　�、� 就動(dòng)物細(xì)胞而言，應(yīng)在-20℃范圍內(nèi)以1℃/min左右的速度緩慢降溫，此后必須盡快降到貯藏溫度;而對(duì)絕大多數(shù)微生物而言，則不必如此，如結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜的原蟲則可在-35℃范圍內(nèi)進(jìn)行緩慢降溫，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進(jìn)行冷凍;

　�、� 若進(jìn)行長(zhǎng)期保存，則貯藏溫度越低越好;

　�、� 取用冷凍保存的菌種時(shí)，應(yīng)采取速融措施，即在35～40℃溫水中輕輕振蕩使之迅速融解。而就厭氧菌來(lái)說(shuō)，則應(yīng)選擇靜置融化的措施。當(dāng)冷凍菌融化后，應(yīng)盡量避免再次冷凍，否則菌體的存活率將顯著下降。

常用的冷凍保存法

　�、� 低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：低溫冷凍保存時(shí)使用螺旋口試管較為方便，也可在棉塞試管外包裹塑料薄膜。保存時(shí)菌液加量不宜過(guò)多，有些可添加保護(hù)劑。此外，也可用φ5mm的玻璃珠來(lái)吸附菌液，然后把玻璃珠置于塑料容器內(nèi)，再放入低溫冰箱內(nèi)進(jìn)行保存的。

　�、� 干冰保存法(-70℃左右)：即將菌種管插入干冰內(nèi)，再置于冰箱內(nèi)進(jìn)行冷凍保存。

　�、� 液氮保存法(-196℃)：是適用范圍最廣的微生物保存法。其操作步驟如下：

　　a.裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮于含有適當(dāng)防凍劑(保存霉菌不用防凍劑)的滅菌溶液中，將0.2～1ml的這種溶液分裝于安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種，或?qū)⒕�絲體瓊脂塊直接懸浮于分散劑中。

　　b.熔封安瓶管：若直接貯存于氣相液氮中(-150℃～-170℃)時(shí)，則不需熔封。

　　c.檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當(dāng)?shù)纳�素溶液中浸�?～30分鐘后，觀察有無(wú)色素進(jìn)入安瓶。

　　d.緩慢冷卻：將熔封安瓶管置于小罐中，然后用液氮?dú)庖约s1℃/min的速度冷卻至-25℃左右，也可在-20℃～-25℃的冰箱內(nèi)緩慢冷卻30～60min。

　　e.速冷：最后浸入液氮中快速冷卻至-196℃。

冷凍干燥保存法

　　它的原理是首先將微生物冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分。從菌體中除去大部分水分后，細(xì)胞的生理活動(dòng)就會(huì)停止，因此可以達(dá)到長(zhǎng)期維持生命狀態(tài)的目的。該方法適用于絕大多數(shù)微生物菌種(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進(jìn)行冷凍干燥時(shí)，需注意以下幾個(gè)問(wèn)題：

　　a.冷凍干燥前的培養(yǎng)條件：首先檢驗(yàn)菌種純度。一般地說(shuō)，將待保存的微生物在營(yíng)養(yǎng)豐富且容易增菌的培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)為宜;菌齡以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以后進(jìn)行保存為好;菌液濃度以高為好，如細(xì)菌應(yīng)達(dá)到109～1010/ml。

　　b.菌株號(hào)碼等的標(biāo)記：可在安瓶外側(cè)標(biāo)記或在安瓶?jī)?nèi)封入標(biāo)簽。

　　c.安瓶的準(zhǔn)備：將安瓶在2%HCl中浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖洗3次后，蒸餾水刷凈，干燥，塞棉塞，貼標(biāo)簽，干熱滅菌或溫?zé)釡缇�后�?0℃恒溫干燥。

　　d.添加保護(hù)劑：常用的保護(hù)劑有脫脂乳、12%蔗糖、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等等。

Bordelli氏法

　　取干凈的小試管(8×60mm)塞上棉塞，滅菌。用滅菌的脫脂牛乳洗脫試管斜面上的菌苔，制成濃厚菌懸液。然后用無(wú)菌吸管將菌懸液滴入小試管底部。每管一滴，然后轉(zhuǎn)動(dòng)小試管使菌液分散在試管底部的壁上。標(biāo)記菌名。將小試管裝在15×150mm的試管中，在大試管底部事先裝上1.5cm高的(P2O5或KOH)，管口用帶玻璃管的橡皮塞塞緊，蠟封。將大試管與真空泵連通，抽真空至0.1～0.2mm汞柱時(shí)，將玻璃管熔封，置室溫暗處或冰箱保存。