SUMO化修飾調(diào)控m6A RNA甲基化酶METTL3及其催化功能的一種全新分子機(jī)制

RNA甲基化是目前最炙手可熱的研究領(lǐng)域，近3個(gè)月以來(lái)，該方向影響因子10分以上的文章數(shù)量竟接近20篇。云序生物曾對(duì)RNA甲基化研究方法及思路進(jìn)行了深度剖析，感興趣的老師可瀏覽云序生物前期公眾號(hào)（2018國(guó)自然熱點(diǎn)二：RNA甲基化研究深度剖析）。

近三個(gè)月高分文章部分列表：

2月28日，又一篇RNA甲基化高分文章問(wèn)世。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院余健秀組在著名期刊《核酸研究》（影響因子：10.162）發(fā)表了題為“SUMOylation of the m6A-RNA methyltransferase METTL3 modulates its function”文章（云序生物提供全套R(shí)NA甲基化測(cè)序技術(shù)服務(wù)）。首次揭示SUMO化修飾調(diào)控m6A RNA甲基化酶METTL3及其催化功能的一種全新分子機(jī)制。

一篇10分以上好文章的課題設(shè)計(jì)總會(huì)先人一步，在我們還費(fèi)盡心思尋找目前大熱m6A RNA甲基化修飾酶時(shí)，大牛課題組已經(jīng)開(kāi)始研究這些酶本身所存在的翻譯后修飾，以及這些修飾的存在對(duì)RNA甲基化所帶來(lái)的影響，給我們帶來(lái)了一道與以往不同的RNA甲基化盛宴：

研究思路：

此次余健秀課題組鑒定了METTL3的SUMO化修飾及其調(diào)控功能。他們發(fā)現(xiàn)，在細(xì)胞中敲低SUMO特異性蛋白酶SENP1可明顯降低細(xì)胞內(nèi)RNA的m6A修飾水平。這一修飾并未影響該蛋白的穩(wěn)定性及其在細(xì)胞中的定位，也未改變?cè)摰鞍缀蚆ETTL14及WTAP之間的相互作用。通過(guò)體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)，他們發(fā)現(xiàn)METTL3的SUMO化修飾可顯著抑制其m6A甲基化轉(zhuǎn)移酶的活性、促進(jìn)特異癌細(xì)胞的克隆形成及腫瘤生成。穩(wěn)定敲除METTL3后，結(jié)合m6A RNA甲基化測(cè)序（MeRIP-seq）及二代高通量測(cè)序（RNA-seq）手段，m6A RNA甲基化修飾圖譜及下游mRNA表達(dá)圖譜均發(fā)生顯著改變。自此，METTL3借助SUMO化修飾調(diào)控下游mRNA m6A修飾及表達(dá)的論點(diǎn)完全成立。 

研究一：METTL3 SUMO化修飾體內(nèi)、體外鑒定

作者通過(guò)Ni+-NTA Pull Down發(fā)現(xiàn)METTL3主要受到SUMO1修飾，通過(guò)SUMO水解酶Senp1處理后，發(fā)現(xiàn)METTL3 SUMO修飾水平確實(shí)下降。細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)METTL3也與SUMO1特異性互作，顯著發(fā)生SUMO化。作者隨后采用藥物刺激細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)體內(nèi)METTL3 SUMO化水平會(huì)發(fā)生顯著改變。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)二者之間具有相互作用，作者補(bǔ)充了Co-IP實(shí)驗(yàn)，體內(nèi)證實(shí)METTL3 SUMO化水平受SUMO1調(diào)控。為了鑒定體內(nèi)METTL3修飾位點(diǎn)，作者構(gòu)建了一系列METTL3 K-R突變體，最終鑒定到，METTK3K177/211/212/215為SUMO化底物修飾位點(diǎn)。

研究二：METTL3 SUMO化修飾作用

蛋白質(zhì)SUMO化修飾與其定位，穩(wěn)定性及蛋白互作等生物過(guò)程相關(guān)，作者隨后對(duì)METTL3 SUMO化修飾的生理功能在上述三個(gè)方向進(jìn)行了驗(yàn)證。首先，作者通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)METTL3 SUMO化并不影響其蛋白質(zhì)本身的穩(wěn)定性。隨后作者排除了METTL3 SUMO化對(duì)其細(xì)胞定位的影響。最后作者發(fā)現(xiàn)METTL3 SUMO化程度的改變并不能影響其與METTL14或者WTAP之間的相互作用，至此，三種SUMO化經(jīng)典機(jī)制都被排除掉。那么，依據(jù)對(duì)METTL3具有RNA甲基轉(zhuǎn)移酶活性的認(rèn)知，METTL3 SUMO化極有可能影響其酶活性。幸運(yùn)的是，作者發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)METTL3后，細(xì)胞mRNA m6A甲基化修飾水平顯著升高，但當(dāng)同時(shí)提升METTL3 SUMO化修飾水平后，胞內(nèi)mRNA m6A甲基化修飾水平顯著下降。這一部分?jǐn)?shù)據(jù)有利的證實(shí)了METTL3 SUMO化主要影響其m6A RNA甲基化轉(zhuǎn)移酶活性。

研究三：METTL3 SUMO化轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)調(diào)控

作者通過(guò)異位成瘤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)成瘤大小與體內(nèi)m6A修飾水平負(fù)相關(guān)。作者補(bǔ)充METTL3-WT（正常SUMO化）及METTL3-4KR（非SUMO化）細(xì)胞系m6A RNA甲基化測(cè)序（MeRIP-seq）及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-seq）分析，結(jié)果顯示METTL3-4KR細(xì)胞系整體m6A修飾水平上升，尤其是在3’ UTR靠近Stop Codon區(qū)域。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)顯示，METTL3敲除細(xì)胞系中分別表達(dá)METTL3-WT及METTL3-4KR后，大量轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)量發(fā)生顯著性改變。將兩套高通量數(shù)據(jù)聯(lián)合應(yīng)用分析后，發(fā)現(xiàn)90個(gè)基因無(wú)論是m6A RNA甲基化修飾水平或轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量均發(fā)生顯著性改變。上述實(shí)驗(yàn)證實(shí)METTL3 SUMO化會(huì)降低mRNA m6A修飾水平，進(jìn)而影響轉(zhuǎn)錄組表達(dá)水平，最終促進(jìn)腫瘤的生成。

總結(jié)：

這項(xiàng)研究首次發(fā)現(xiàn)m6A RNA甲基化修飾催化酶存在蛋白質(zhì)修飾。研究組同時(shí)認(rèn)為這些關(guān)鍵蛋白質(zhì)肯定還存在其它蛋白質(zhì)翻譯后修飾（PTMs），有待被進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，這些PTMs包括泛素化、磷酸化、甲基化、乙�；�等。本文在論文評(píng)審中，得到論文評(píng)審專(zhuān)家的高度肯定，其中一個(gè)referee指出，這項(xiàng)研究給m6A修飾調(diào)控帶來(lái)了新元素，回答了METTL3如何自我調(diào)控的科學(xué)問(wèn)題（“This paper brings new element insight METTL3 SUMOylation and m6A modification regulation, answering question of METTL3 self-regulation”）；有趣的是，另外一個(gè)referee還特意提到了余健秀實(shí)驗(yàn)室在SUMO研究領(lǐng)域中所取得的重大貢獻(xiàn)（“Just one more comment. I obviously am aware that the lab has made significant contributions to the SUMO field”）。上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與細(xì)胞分子生物系余健秀研究員和趙嫻博士后為該論文共同通訊作者，碩士研究生杜玉樟和聯(lián)合培養(yǎng)博士研究生侯國(guó)芳為論文共同第一作者，陳國(guó)強(qiáng)院士和程金科教授也參與了該研究。此外，該研究還得到了浙江大學(xué)劉建釗研究員在質(zhì)譜鑒定m6A修飾的大力幫助。云序生物很榮幸的參與到了這一項(xiàng)精彩的研究中，承擔(dān)了m6A RNA甲基化測(cè)序工作及數(shù)據(jù)分析。作為國(guó)內(nèi)最早開(kāi)展RNA甲基化測(cè)序服務(wù)的科研服務(wù)單位之一，云序獨(dú)家提供全面的m6A﹑m1A﹑m5C RNA甲基化測(cè)序技術(shù)服務(wù)，志在為各位老師的科研工作保駕護(hù)航。

作者簡(jiǎn)介：

余健秀,男，博士，現(xiàn)任上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院特聘教授、博士生導(dǎo)師。1990獲華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)士學(xué)位，1996年、2000年分別獲中山大學(xué)動(dòng)物學(xué)與分子生物學(xué)碩士、博士學(xué)位。2009年9月至今，任上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子細(xì)胞學(xué)系PI、特聘教授，癌基因及相關(guān)基因國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室特聘研究員。已在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Nature Chemical Biology, Molecular Cell, Nature Communications, EMBO J, Nucleic Acids Research等發(fā)表研究論文50多篇。主持國(guó)家自然科學(xué)重點(diǎn)、重大研究計(jì)劃、面上項(xiàng)目以及國(guó)家科技部重大項(xiàng)目子項(xiàng)目等課題十多項(xiàng)，多次擔(dān)任國(guó)家衛(wèi)計(jì)委“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專(zhuān)項(xiàng)驗(yàn)收專(zhuān)家、國(guó)家自然科學(xué)基金醫(yī)學(xué)科學(xué)領(lǐng)域?qū)W科評(píng)審組成員（二審專(zhuān)家）及國(guó)家自然科學(xué)基金委重大項(xiàng)目評(píng)審、驗(yàn)收專(zhuān)家。主要致力于（1）探討蛋白質(zhì)修飾在腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用及其分子機(jī)制，首次鑒定了PTEN的SUMO化修飾，發(fā)現(xiàn)其直接介導(dǎo)PTEN膜結(jié)合而抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展，解析了PTEN-PI3K-AKT通路的分子機(jī)制；（2）蛋白質(zhì)修飾調(diào)控非編碼RNA生成和代謝的作用機(jī)制，其系列研究揭示了由蛋白質(zhì)修飾介導(dǎo)的非編碼RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和作用方式。如首次發(fā)現(xiàn)miRNA/siRNA作用效率受控于TARBP2的SUMO化修飾程度等。

參考文獻(xiàn)：Circular RNA expression alteration in exosomes from the brain extracellular space after traumatic brain injury in mice

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