RIP測(cè)序解析RNA結(jié)合蛋白SORBS2在卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制

作為環(huán)狀RNA和RNA甲基化領(lǐng)域的領(lǐng)跑者，云序生物最近一個(gè)月捷報(bào)頻傳。RNA甲基化領(lǐng)域，云序m6ARNA甲基化測(cè)序服務(wù)協(xié)助上海交大余健秀組發(fā)表18年國(guó)內(nèi)首篇10分以上RNA甲基化文章（“Nucleic Acid Research”，IF:10.162)；環(huán)狀RNA領(lǐng)域，云序環(huán)狀RNA測(cè)序服務(wù)助力多篇世界第一篇，包括：世界第一篇小鼠大腦創(chuàng)傷外泌體環(huán)狀RNA研究，世界第一篇非洲爪蟾環(huán)狀RNA研究，世界第一篇紅斑狼瘡性腎炎環(huán)狀RNA研究(Cell子刊，IF:6.329)。

近日，又一個(gè)云序獨(dú)家產(chǎn)品：RIP測(cè)序（RIP-Seq）助力華西醫(yī)學(xué)院發(fā)表12分頂級(jí)期刊。四川大學(xué)周圣濤團(tuán)隊(duì)巧用RIP測(cè)序解析RNA結(jié)合蛋白SORBS2在卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制，為卵巢癌的靶向治療提供了重要依據(jù)，課題思路新穎﹑非常具有借鑒性。

研究背景：

卵巢癌是一種致死率很高的婦科惡性腫瘤。由于介導(dǎo)該疾病發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制還未被清楚闡釋?zhuān)�針�?duì)該疾病的治療和診斷效果一直不理想。此外，基于RBP （RNA binding protein，RNA結(jié)合蛋白）的mRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是否與卵巢癌以及免疫功能相關(guān)仍不確定。文章通過(guò)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)（cBioPortal TCGA，AOCS等）明確SORBS2 (Sorbin and SH3 domain containing 2) 作為卵巢癌轉(zhuǎn)移抑制的關(guān)鍵分子并且SORBS2的表達(dá)量與卵巢癌病人的預(yù)后相關(guān)，SORBS2敲減實(shí)驗(yàn)證明該分子主要影響卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移而不會(huì)顯著改變?cè)鲋承盘?hào)通路。RIP測(cè)序（云序生物提供）聯(lián)合全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的相關(guān)生物信息學(xué)分析提示SORBS2結(jié)合并穩(wěn)定部分轉(zhuǎn)錄本，其中WFDC1和IL-17D作為SORBS2結(jié)合的重要靶點(diǎn)可以抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移灶的定殖。

研究思路：

作者通過(guò)對(duì)所有編碼RBP的基因進(jìn)行了兩次基于數(shù)據(jù)庫(kù)的篩選打分將與卵巢癌相關(guān)的關(guān)鍵分子鎖定至SORBS2。 為了尋找SORBS2的潛在下游靶點(diǎn)，RIP-Seq 將SORBS2-RNA復(fù)合物免疫富集，對(duì)SORBS2結(jié)合的RNA進(jìn)行測(cè)序，高通量分子測(cè)序結(jié)果給出了和SORBS2結(jié)合的所有RNA分子。此外，轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)（Transcript Stability Assays）對(duì)SORBS2敲減細(xì)胞系中所有的轉(zhuǎn)錄本半衰期進(jìn)行計(jì)算從而得到所有因?yàn)镾ORBS2敲減穩(wěn)定性下降的轉(zhuǎn)錄本。比較SORBS2結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本（來(lái)自RIP-Seq）數(shù)據(jù)集和轉(zhuǎn)錄本穩(wěn)定性數(shù)據(jù)集（全轉(zhuǎn)錄組穩(wěn)定性分析），被SORBS2直接結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本在SORBS2敲減后穩(wěn)定性下降的轉(zhuǎn)錄本集合中有明顯富集。該結(jié)果證明在卵巢癌當(dāng)中，SORBS2可以通過(guò)與轉(zhuǎn)錄本直接結(jié)合從而使轉(zhuǎn)錄本更加穩(wěn)定。SORBS2結(jié)合的轉(zhuǎn)錄本當(dāng)中，91個(gè)（8.38%）作為卵巢癌轉(zhuǎn)移SORBS2下游的潛在靶點(diǎn)。根據(jù)這些潛在靶點(diǎn)是否表達(dá)分泌蛋白進(jìn)一步把范圍縮小至7個(gè)基因，經(jīng)過(guò)臨床樣本分析、回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)和其他分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，由SORBS2直接結(jié)合的WFDC1和IL-17D在SORBS2敲減后下降，并且這兩個(gè)基因可以抑制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶定殖。后續(xù)工作還明確了SORBS2識(shí)別并且穩(wěn)定這些具有癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移抑制作用轉(zhuǎn)錄本的作用域ZnF_C2H2，SORBS2敲減介導(dǎo)的分泌蛋白質(zhì)組改變和單核細(xì)胞（monocyte）到骨髓衍生抑制細(xì)胞（MDSCs）和M2樣巨噬細(xì)胞極化相關(guān)。

研究一：從數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選確定SORBS2

基于RBP對(duì)于mRNA的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控是否與卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移以及免疫功能相關(guān)還不清除，如何建立RBP和該疾病的聯(lián)系是首先需要回答的問(wèn)題�；�于三個(gè)原則和已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)對(duì)1345個(gè)RBP編碼蛋白進(jìn)行打分，三個(gè)打分條件分別是1）腫瘤組織中的表達(dá)量低于正常組織；2）轉(zhuǎn)移灶處表達(dá)量比原發(fā)處表達(dá)量低；3）與干細(xì)胞狀態(tài)呈負(fù)相關(guān)。初篩將范圍縮小至145 RBP基因。根據(jù)TCGA數(shù)庫(kù)中這些基因的擴(kuò)增（amplification）和刪減（deletion）情況，確定其中四個(gè)BTF3、SORBS2、CIBRP和MEX3D最有可能與卵巢癌相關(guān)的基因。Transwell實(shí)驗(yàn)和siRNA實(shí)驗(yàn)證明SORBS2和MEX3D敲減可以增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移灶定殖能力。結(jié)合AOCS數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)值，TCGA數(shù)據(jù)庫(kù)的GSEA分析結(jié)果（TGF-beta和細(xì)胞黏附）均進(jìn)一步證明SORBS2是抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵RBP。臨床樣本信息庫(kù)（CSIOVDB、West China cohort of ovarian cancer）同樣證明SORBS2與卵巢癌病人的治療效果相關(guān)，臨床分級(jí)越高，癌細(xì)胞分化程度越高且病人預(yù)后越差時(shí)，SORBS2表達(dá)下調(diào)越明顯。同時(shí)分子實(shí)驗(yàn)證明，在卵巢癌細(xì)胞系中沉默SORBS2在體內(nèi)體外均增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移，但不影響這些細(xì)胞的增值和生長(zhǎng)速率。

研究二：高通量測(cè)序結(jié)果鎖定WFDC1和IL-17D

既然SORBS2的細(xì)胞表型與功能都已確定，那么這一重要的RBP如何在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮作用？哪些SORBS2靶標(biāo)最關(guān)鍵？云序生物RIP測(cè)序結(jié)果給出所有SORBS2直接結(jié)合的靶點(diǎn)，聯(lián)合全轉(zhuǎn)錄組范圍RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)以及全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果證明SORBS2可以與部分轉(zhuǎn)錄本結(jié)合并使他們更加穩(wěn)定，其中91個(gè)基因被鎖定。功能分析（GO分析和KEGG通路分析）表明這些基因發(fā)揮著絲粒組裝等生物學(xué)功能并富集于FoxO等信號(hào)通路。這91個(gè)基因中僅7個(gè)基因可以編碼分泌蛋白，其中WFDC1和IL-17D在SORBS2敲減后穩(wěn)定性降低。分子實(shí)驗(yàn)證明無(wú)論過(guò)表達(dá)或者沉默SORBS2，WFDC1和IL-17D穩(wěn)定性相對(duì)應(yīng)的增強(qiáng)或減弱。SOSRBS2調(diào)節(jié)兩者穩(wěn)定性的方式是結(jié)合3’UTR區(qū)域而不改變3’UTR的長(zhǎng)度。明確SORBS2與WFDC1和IL-17D的聯(lián)系之后，這種結(jié)合并穩(wěn)定的關(guān)系在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮怎樣的生物學(xué)功能？臨床信息顯示，SORBS2表達(dá)量低的病人樣本中WFDC1和IL-17D的表達(dá)量也相對(duì)較低。無(wú)論動(dòng)物實(shí)驗(yàn)（測(cè)轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)）還是細(xì)胞實(shí)驗(yàn)（Transwell侵襲模型），回補(bǔ)過(guò)表達(dá)WFDC1或者IL-17D都能抑制卵巢癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力或侵襲能力。

研究三：結(jié)合功能域和免疫調(diào)節(jié)

SORBS2主要含有三種結(jié)構(gòu)域，SoHo、ZnF_C2H2以及SH3, 三個(gè)突變實(shí)驗(yàn)分別對(duì)應(yīng)突變一個(gè)結(jié)構(gòu)域。卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)ZnF_C2H2是SORBS2結(jié)合并穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本時(shí)所必須的功能結(jié)構(gòu)域。既然WFDC1和IL-17D都是SORBS2低表達(dá)癌癥細(xì)胞的分泌因子，那么它們是否對(duì)卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的腫瘤微環(huán)境有影響？實(shí)驗(yàn)證明SORBS2敲減介導(dǎo)分泌蛋白改變與單核細(xì)胞、MDSC和M2型巨噬細(xì)胞極化相關(guān)，SORBS2在腫瘤微環(huán)境中有穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本和免疫調(diào)節(jié)作用。源于癌癥的SORBS2穩(wěn)定的分泌蛋白體可以有效地抑制卵巢癌轉(zhuǎn)移并調(diào)節(jié)體內(nèi)腫瘤促進(jìn)性骨髓細(xì)胞的積聚。

結(jié)語(yǔ)：

文章揭示了RNA結(jié)合蛋白SORBS2在卵巢癌腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要生物學(xué)作用，從數(shù)據(jù)庫(kù)搜索到通過(guò)RIP-seq鎖定SORBS2靶基因，相關(guān)結(jié)果提出了一個(gè)全新的連接癌癥發(fā)展和免疫調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，這一網(wǎng)絡(luò)依賴(lài)于SORBS2結(jié)合并穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄本的重要生物學(xué)作用。

原文：

The RNA binding protein SORBS2 suppresses metastatic colonization of ovarian cancer by stabilizing tumorsuppressive immunomodulatory transcript  Genome Biol, 2018, DOI: 10.1186/s13059-018-1412-6.

作者簡(jiǎn)介：

周圣濤教授，四川大學(xué)華西第二醫(yī)院黨委委員、婦產(chǎn)科副主任醫(yī)師。團(tuán)隊(duì)主要圍繞卵巢癌等婦科惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展分子機(jī)制領(lǐng)域開(kāi)展系統(tǒng)研究，在蛋白質(zhì)組學(xué)及RNA領(lǐng)域和腫瘤微環(huán)境調(diào)控癌細(xì)胞可塑性與腫瘤轉(zhuǎn)移領(lǐng)域取得了系統(tǒng)性的創(chuàng)新成果，其中包括在Genome Biology、PNAS、Cancer Research、Oncogene、Mass Spectrometry Reviews、Molecular & Cellular Proteomics等國(guó)際著名雜志發(fā)表的論文。

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