細(xì)胞誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶活性比色法定量檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品使用說明書

主要用途

YIJI細(xì)胞誘導(dǎo)型巨噬細(xì)胞一氧化氮合成酶（iNOS /NOS2/mNOS）活性比色法定量檢測(cè)試劑是一種旨在通過誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶、硝酸還原酶和乳酸脫氫酶反應(yīng)系統(tǒng)，在誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶特異性抑制劑存在與否的情況下，由底物L(fēng)-精氨酸被催化產(chǎn)生一氧化氮，再轉(zhuǎn)化為亞硝酸，然后使用Griess試劑，得到紫紅或粉紅色偶氮化合物產(chǎn)物，通過觀察其吸光峰值的變化，即采用比色法來測(cè)定細(xì)胞樣品中誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶活性的權(quán)威而經(jīng)典的技術(shù)方法。該技術(shù)經(jīng)過精心研制、成功實(shí)驗(yàn)證明的。其適用于各種細(xì)胞裂解懸液樣品（動(dòng)物、人體、昆蟲等）的誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶的活性檢測(cè)。產(chǎn)品嚴(yán)格無菌，即到即用，操作簡(jiǎn)捷，性能穩(wěn)定，重復(fù)性好。

技術(shù)背景

一氧化氮合成酶（nitric oxide synthase；NOS；EC1.14.13.39）是鈣調(diào)蛋白（calmodulin）依賴性或含鈣調(diào)蛋白的細(xì)胞色素p450類血紅素蛋白（hemoprotein），分子量為130至160KD的二體蛋白，其催化結(jié)構(gòu)域包括還原酶、加氧酶、黃素腺嘌呤二核苷酸（Flavin adenine dinucleotide；FAD）、核黃素單苷酸（flavin mononucleotide；FMN）等要素，在輔助因子四氫生物喋呤（tetrahydro-biopterin）的幫助下，進(jìn)行非芳香類氨基酸L-精氨酸（L-arginine）的5’端電子氧化。一氧化氮合成酶催化L-精氨酸末端的氮原子，在還原性煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）和氧氣的參與下，成為一氧化氮（nitric oxide）的合成反應(yīng)。一氧化氮合成酶有三種異構(gòu)體：神經(jīng)元型（neuronal NOS；nNOS；NOS1）、內(nèi)皮細(xì)胞型（endothelial NOS；eNOS；NOS3）和巨噬細(xì)胞型（macrophage NOS；mNOS；NOS2），前二者為結(jié)構(gòu)型一氧化氮合成酶（constitutive NOS；cNOS），后者為誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶（inducible NOS；iNOS）。iNOS屬于無鈣性，是在細(xì)胞因子如白介素-1(IL-1)、腫瘤壞死因子(TNF)、干擾素-γ(IFN－γ)、內(nèi)毒素等誘導(dǎo)下由血管平滑肌細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及上皮細(xì)胞產(chǎn)生的。其作用產(chǎn)生的NO遠(yuǎn)多于由cNOS作用產(chǎn)生的NO為多。誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶與免疫反應(yīng)、抵抗病源微生物等機(jī)制有關(guān)，尤其在敗血癥休克、自主免疫性疾病等發(fā)揮作用。基于底物L(fēng)-精氨酸，在誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶特異性抑制劑氨基胍（aminoquanidine）存在與否的情況下，以及NADPH和氧氣的參與下，由誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶催化產(chǎn)生一氧化氮?dú)怏w和瓜氨酸（citrulline）；在液體中，一氧化氮迅速轉(zhuǎn)變成穩(wěn)定且不揮發(fā)的硝酸和亞硝酸，進(jìn)而使用硝酸還原酶（nitrate reductase；NaR），催化硝酸還原為亞硝酸的反應(yīng)，然后通過格里斯試劑（Griess Reagent）氨苯磺胺（sulfanilamide）和N-(1-萘基)乙二胺二鹽酸鹽（N-(1-Naphthyl)ethylenediamine dihydrochloride；NED），在酸性條件下的重氮化（diazotization）反應(yīng)，產(chǎn)生紫紅或粉紅色的偶氮化合物（Azo compound），通過其吸收峰值的變化（540nm波長(zhǎng)），同時(shí)使用乳酸脫氫酶系統(tǒng)去除多余NADPH對(duì)于格里斯反應(yīng)的干擾，由此來定量分析誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶的活性。其反應(yīng)方式為： 

產(chǎn)品內(nèi)容

YIJI清理液（Reagent A） 毫升

YIJI裂解液（Reagent B） 毫升

YIJI緩沖液（Reagent C） 毫升

YIJI反應(yīng)液（Reagent D） 毫升

YIJI酶解液（Reagent E）  毫升

YIJI底物液（Reagent F）    毫升

YIJI顯色液（Reagent G）    毫升

YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）  微升

YIJI專性液（Reagent I）       微升

產(chǎn)品說明書      1份

保存方式

保存YIJI反應(yīng)液（Reagent D）、YIJI酶解液（Reagent E）和YIJI專性液（Reagent I）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；YIJI反應(yīng)液（Reagent D）和YIJI顯色液（Reagent G）避免光照；有效保證6月

用戶自備

YIJI完全緩沖液（Reagent J）：用于檢測(cè)純化誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶或體外檢測(cè)

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

1.5毫升離心管：用于制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的容器

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品處理

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

恒溫水槽：用于反應(yīng)孵育

96孔板或比色皿：用于比色的容器

酶標(biāo)儀或分光光度儀：用于樣品比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

實(shí)驗(yàn)開始前，設(shè)定好分光光度儀或酶標(biāo)儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)540nm，并置零。然后進(jìn)行下列操作。

一、樣品準(zhǔn)備

• 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）
• 小心抽去培養(yǎng)液
• 小心加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面
• 小心抽去清理液
• 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：避免使用胰酶消化）
• 加入xx毫升YIJI清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
• 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）
• 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
• 小心抽去上清液
• 加入xx毫升YIJI裂解液（Reagent B）
• 渦旋震蕩5秒，充分混勻
• 即刻放入預(yù)冷的DOUNCE勻漿器
• 在冰槽里用研磨棒勻化（約80下）
• 將所有勻漿物移入2毫升離心管
• 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心10分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）
• 小心移取1毫升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
• 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、標(biāo)準(zhǔn)樣品配制

• 準(zhǔn)備好5個(gè)1.5毫升離心管，標(biāo)記為1至5號(hào)管
• 分別加入xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到2至5號(hào)管
• 移取xx微升YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到1號(hào)管
• 小心移取xx微升1號(hào)管的YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到2號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升2號(hào)管稀釋的YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到3號(hào)管，混勻
• 小心移取xx微升3號(hào)管稀釋的YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）到4號(hào)管，混勻
• 將1至5號(hào)管放進(jìn)冰槽里備用，避免光照；標(biāo)準(zhǔn)管濃度見下表

• 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升上述配制的YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
• 室溫下孵育60分鐘
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）
• 室溫下，孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 重復(fù)實(shí)驗(yàn)步驟1至11四次
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)一氧化氮濃度（微摩爾/升）

• 樣品總活性測(cè)定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入40微升上述準(zhǔn)備的待測(cè)樣品（注意：細(xì)胞裂解樣品為50微克蛋白）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
• 室溫下孵育60分鐘 
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對(duì)應(yīng)一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 計(jì)算樣品酶總活性

• 樣品非特異活性測(cè)定

• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
• 加入xx微升YIJI專性液（Reagent I）
• 加入40微升上述準(zhǔn)備的待測(cè)樣品（注意：細(xì)胞裂解樣品為50微克蛋白）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 槍頭抽吸數(shù)次，混勻
• 室溫下孵育60分鐘 
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）
• 室溫下孵育10分鐘，避免光照
• 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品非特異活性對(duì)應(yīng)一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 計(jì)算樣品酶非特異活性

• 計(jì)算樣品活性

• 酶標(biāo)儀測(cè)定

• 樣品總活性測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：標(biāo)準(zhǔn)樣品和待測(cè)樣品
• 分別移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到所有孔里
• 分別加入xx微升上述配制的YIJI標(biāo)準(zhǔn)液（Reagent H）或待測(cè)樣品（注意：細(xì)胞裂解樣品為50微克蛋白）到相應(yīng)孔里
• 分別加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 室溫下孵育60分鐘 
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）到所有孔里
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）到所有孔里
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 室溫下孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線：縱座標(biāo)（Y軸）為吸光讀數(shù)；橫座標(biāo)（X軸）為標(biāo)準(zhǔn)一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品總活性對(duì)應(yīng)一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 計(jì)算樣品酶總活性

2）樣品非特異活性測(cè)定

• 在96孔板上做好相應(yīng)標(biāo)記：待測(cè)樣品
• 移取xx微升YIJI緩沖液（Reagent C）到相應(yīng)孔里
• 加入xx微升YIJI專性液（Reagent I）
• 加入40微升待測(cè)樣品（注意：細(xì)胞裂解樣品為50微克蛋白）
• 加入xx微升YIJI反應(yīng)液（Reagent D）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 室溫下孵育60分鐘 
• 加入xx微升YIJI酶解液（Reagent E）
• 室溫下孵育20分鐘
• 加入xx微升YIJI底物液（Reagent F）
• 加入xx微升YIJI顯色液（Reagent G）
• 輕輕搖動(dòng)96孔板
• 室溫下孵育10分鐘
• 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：獲得吸光讀數(shù)
• 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得樣品非特異活性對(duì)應(yīng)一氧化氮濃度（微摩爾/升）
• 計(jì)算樣品酶非特異活性

3）樣品特異活性計(jì)算

注意事項(xiàng)

• 本產(chǎn)品為25次操作，包括標(biāo)準(zhǔn)樣品
• 操作時(shí)，須戴手套
• 本產(chǎn)品不適宜于純化或粗提誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶樣品的檢測(cè)；如果需要檢測(cè)，建議另購(gòu)使用YIJI完全緩沖液（Reagent J） 
• 樣品中避免含有各種還原性化學(xué)物質(zhì)，包括巰基乙醇（2－mercaptoethanol）、二硫蘇糖醇（dithiothreitol；DTT）、維生素C（ascorbic acid）和疊氮化鈉（azide）等
• 如果用戶沒有540nm波長(zhǎng)的濾波器，可以使用530至560nm之間的任一波長(zhǎng)替代
• 避免使用胰酶脫離貼壁細(xì)胞
• 比色測(cè)定后，比色皿須清洗徹底
• 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/40微升（本公司提供 YIJI Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒）
• 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以增加或減少甚至稀釋樣品量
• 誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶單位活性定義為：在25℃，pH 7.5條件下，每分鐘內(nèi)能夠生成1微摩爾一氧化氮所需的氨基胍敏感性酶量作為一個(gè)活性單位
• 本公司提供系列一氧化氮合成酶分析試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定
• 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感