分離病毒及構(gòu)建假病毒在抗疫研究中的應(yīng)用
新冠疫情已經(jīng)在全球范圍爆發(fā)，目前確診感染人數(shù)已經(jīng)超過190萬，并且這一數(shù)值還在持續(xù)增長中。在疫情爆發(fā)初期，我國科研戰(zhàn)線迅速行動，不到一周時間就確定了新冠病毒的全基因組序列并分離得到了病毒毒株，及時向全球共享。那么為什么分離病毒毒株這么重要呢？
毒株分離的意義和難度
病毒毒株的分離對于疫情的防控、抗病毒藥物的篩選、疫苗研制等都具有重要意義。首先，分離病毒毒株后，可以得到新冠病毒包括衣殼蛋白、全基因組序列在內(nèi)的更詳細(xì)的信息，幫助快速診斷試劑盒的研發(fā)，這對于新冠肺炎患者的臨床診斷和治療有非常積極的幫助。其次，得到病毒毒株后，將助力于其致病機(jī)理的研究，例如新冠病毒與宿主的結(jié)合機(jī)制、感染病毒后細(xì)胞內(nèi)的免疫應(yīng)答等等。最后，病毒毒株的成功分離可以幫助進(jìn)行抗病毒藥物的篩選和疫苗的研發(fā)。正如中國工程院李蘭娟院士所說，“分離出病毒毒株，意味著我們已經(jīng)擁有了疫苗的種子株。用其制作疫苗株并通過檢測后，就可以制備疫苗”。
左圖1：新冠病毒電鏡照片（來自中國微生物組數(shù)據(jù)中心）；右圖2：新冠病毒透射顯微鏡圖像（來自NIAID-RML)假病毒及病毒載體揭秘
隨著科學(xué)家們不斷深入地了解和研究，開發(fā)表達(dá)刺突蛋白（S蛋白）的新冠假病毒成為輔助治療性篩選的有力工具。截止到目前為止已有多篇基于SARS-CoV-2假病毒中和抗體活性檢測的文章發(fā)表在國際權(quán)威雜志上。假病毒不僅可應(yīng)用于血清中和抗體檢測，還為后續(xù)單克隆抗體及抗病毒藥物篩選和評價、疫苗研發(fā)及病毒感染機(jī)制研究等奠定了基礎(chǔ)。
圖3：由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)研究所的研究團(tuán)隊在國際頂級學(xué)術(shù)期刊Nature的子刊Nature Communication上發(fā)表 ——《Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entryand its immune cross-reactivity with SARS-CoV》。此項研究構(gòu)建SARS-CoV-2 S蛋白假病毒系統(tǒng)和293T的hACE2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，以此確定SARS-CoV-2的易感細(xì)胞系、病毒受體、侵入途徑和蛋白酶激活，揭示了SARS-CoV-2入侵人體細(xì)胞的具體過程。
圖4：SARS-CoV-2-S假病毒包裝過程，圖片來源醫(yī)麥新觀察丨《新冠病毒株極難獲得，假病毒提供解決方案助力藥物開發(fā)》
假病毒是依據(jù)已公開的序列而制備成一種具有原病毒的基本特點和免疫原性，同時又不具備致病性，方便實驗室大規(guī)模使用的替代物。由于其生物安全風(fēng)險較低（僅要求實驗室生物安全級別二級(BSL-2)），質(zhì)控方法可控，可以長期穩(wěn)定制備和供應(yīng)。假病毒因其具有“逼真” 、穩(wěn)定、安全等特點，已被廣泛用于研究感染機(jī)制，受體識別和病毒抑制，以及開發(fā)和評估抗體和疫苗。
假病毒構(gòu)建通常都依賴于病毒載體系統(tǒng)的重組包裝(圖5)，理想的病毒載體同樣也表現(xiàn)出基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞型特異性、有效感染率高、對受感染細(xì)胞生理機(jī)能影響小，同時致病性小等特點。借助病毒載體，例如，慢病毒 (Lentivirus)、水泡性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus, VSV)、腺病毒 (Adenovirus)、腺相關(guān)病毒(Adeno-associated Virus, AAV)將外源基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞并構(gòu)建新的假病毒模型已被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究，科學(xué)家已經(jīng)探索了出多種用于創(chuàng)建包膜型假病毒的包裝系統(tǒng)，用于諸如埃博拉病毒(EBOV)，馬爾堡病毒(MARV)和拉沙熱病毒(LASV)等新興傳染病(EID)的研究。
科研人員使用假病毒模擬抗體阻斷病毒進(jìn)入細(xì)胞的生物過程，檢測抗體或血清對假病毒是否具有中和活性 (假病毒通常經(jīng)過改造以攜帶熒光素酶報告基因，使其進(jìn)行定量分析時比對野生型病毒容易得多，而且已證明假病毒感染的細(xì)胞數(shù)量與報告基因表達(dá)成正比)。圖5：假病毒包裝過程 - 將熒光素酶和gp64基因插入VSV的全長cDNA克隆中（代替G基因命名為ΔG-Luc）。gp64pv和VSVpv是通過將VSVΔG / Luc-* G分別瞬時感染表達(dá)GP64和VSVG的293T細(xì)胞而產(chǎn)生的。
由于病毒與假病毒顆粒較小，直徑基本在20-300納米之間 （新冠病毒電鏡照片顯示其直徑僅為100納米），低轉(zhuǎn)速、低離心力條件并不能使病毒顆粒充分沉降，須借助超速離心技術(shù)來進(jìn)行病毒顆粒分離。
而病毒載體的分離方式與病毒類似—當(dāng)攜帶目的基因的病毒載體感染培養(yǎng)的細(xì)胞，受感染細(xì)胞生產(chǎn)新的同類病毒，并釋放進(jìn)入培養(yǎng)基中，再將新病毒重新采集并純化。在此過程中產(chǎn)生的病毒載量、純度和質(zhì)量都會直接影響后續(xù)載體的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。高效可靠的離心方案同樣有助于優(yōu)化病毒載體純化，例如：在高速和超速離心條件下，能有效地將病毒顆粒從細(xì)胞、細(xì)胞碎片中精細(xì)分離；借助分析性超速離心（AUC） 的流體動力學(xué)和熱力學(xué)全方位精準(zhǔn)測量，則可根據(jù)病毒衣殼密度（一種病毒載量衡量方式），來真實鑒定區(qū)分完整、含部分遺傳物質(zhì)、空殼病毒載體及其他細(xì)胞雜質(zhì)，提高包裝效率，提供藥用級別病毒載體顆粒質(zhì)控 。
您可以通過以下視頻了解病毒純化流程
想了解詳細(xì)的病毒和假病毒分離方法及步驟，請關(guān)注下期內(nèi)容《如何高效分離新冠病毒毒株與假病毒》，小貝將具體解析超離純化病毒的實驗方法，敬請期待！
干貨來啦�。。。�
點擊文末的“閱讀原文”即可免費獲取“病毒及病毒載體分離純化文獻(xiàn)檢索列表”
自1947年第一臺商用超速離心機(jī)發(fā)明以來，貝克曼庫爾特離心技術(shù)已有70多年的發(fā)展歷史。早在19世紀(jì)60年代，已有科學(xué)家使用貝克曼離心機(jī)成功分離了多種病毒顆粒。到今天，貝克曼超速離心技術(shù)已助力科學(xué)家們分離得到冠狀病毒、流感病毒、肝炎病毒、腺病毒、慢病毒等幾乎所有類型的病毒種類。
貝克曼龐大的用戶群體已發(fā)表了數(shù)以萬計的病毒分離方法，為研究人員儲存了大量文獻(xiàn)支持，在助力病毒研究的同時，也使貝克曼離心機(jī)成為了當(dāng)之無愧的病毒分離專家！
參考文獻(xiàn)
1. Xiuyuan Ou et al. Characterization of spike glycoprotein of SARS-CoV-2 on virus entry and its immune cross-reactivity with SARS-CoV. Nat Commun. 2020 Mar 27;11(1):1620.
2. Yuuki Kaname et al. Acquisition of Complement Resistance through Incorporation of CD55/Decay-Accelerating Factor into Viral Particles Bearing Baculovirus GP64. JOURNAL OF VIROLOGY, Apr. 2010, p. 3210–3219 Vol. 84, No. 7
3. Qianqian Li et al. Current status on the development of pseudoviruses for enveloped viruses. Reviews in Medical Virology : Vol 28 , No 1
請點擊“閱讀原文”獲取“病毒及病毒載體分離純化文獻(xiàn)檢索列表”~
