細(xì)胞需要促貼壁的條件與操作指南

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各位親愛(ài)的同（用）學(xué)（戶(hù)）們：

你們好！快快樂(lè)樂(lè)過(guò)暑假，高高興興迎開(kāi)學(xué)！度過(guò)了一個(gè)歡樂(lè)、難忘的暑假生活，BI中國(guó)市場(chǎng)部將與你們一同邁進(jìn)新的一學(xué)期！

新學(xué)期新期許：

做啥實(shí)驗(yàn)都成功�。�

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​上次我們已經(jīng)淺論過(guò)細(xì)胞不貼壁的原因

今天我們來(lái)深扒細(xì)胞貼壁具體與哪些物質(zhì)有關(guān)？

那么如何促進(jìn)細(xì)胞貼壁？

許多細(xì)胞必須添加促貼壁物質(zhì)才能貼壁生長(zhǎng)，

促貼壁物質(zhì)一般為細(xì)胞外基質(zhì)，

如纖連蛋白、層粘連蛋白等。

不同細(xì)胞外基質(zhì)對(duì)細(xì)胞粘附的效果一樣嗎？

細(xì)胞外基質(zhì)的包被濃度是什么標(biāo)準(zhǔn)？

今天我們就來(lái)扒一扒

那些常見(jiàn)的促貼壁物質(zhì)和包被方法~

大部分來(lái)自實(shí)體組織器官的細(xì)胞都會(huì)貼壁，但不是所有的細(xì)胞在體外培養(yǎng)的情況下都會(huì)貼壁。

密度大于培養(yǎng)基的細(xì)胞（絕大部分細(xì)胞）通過(guò)重力作用會(huì)沉降在底面上，這是種自然屬性，那么細(xì)胞要生存必定得改善這個(gè)環(huán)境，也是貼壁的主要原因-分泌細(xì)胞外基質(zhì)和黏附因子（Extracellular matrix& Cell Adhesion Molecules，ECM&CAM），改善底面的結(jié)構(gòu)，然后很自然就貼附在底面上了。

細(xì)胞粘附分子：是眾多介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞之間相互接觸和結(jié)合分子的統(tǒng)稱(chēng)。

細(xì)胞外基質(zhì)：是由動(dòng)物細(xì)胞合并分泌到胞外、分布在細(xì)胞表面或細(xì)胞之間的大分子。

二者大多數(shù)均為糖蛋白，因此具有較強(qiáng)的親水性——因此能不能貼壁不僅僅關(guān)乎細(xì)胞是否有這種能力，也與有無(wú)合適的底物（培養(yǎng)瓶）有關(guān)。

大多數(shù)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞在體內(nèi)和體外均附著于一定的底物而生長(zhǎng)，在體外時(shí)這些底物可以是其他細(xì)胞、膠原、玻璃或塑料等。

貼壁的過(guò)程：細(xì)胞首先分泌細(xì)胞外基質(zhì)，這種細(xì)胞外基質(zhì)黏附在支持物的表面（培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)皿的底面）。然后，細(xì)胞通過(guò)其表面表達(dá)的黏附因子與這些細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合。

   

▲ 貼壁原理圖

一些特殊的促細(xì)胞附著物質(zhì)（如層粘連蛋白、纖維連接蛋白、Ⅲ型膠原、血清擴(kuò)展因子等）可能參加細(xì)胞的貼附過(guò)程。這些促細(xì)胞附著因子均為蛋白質(zhì)，存在于培養(yǎng)液尤其是血清中。在培養(yǎng)過(guò)程中，這些帶陽(yáng)電荷的促貼附因子先吸附于底物上，懸浮的圓形細(xì)胞再與已吸附的有促貼附物質(zhì)的底物附著，之后細(xì)胞將伸展成其原來(lái)的形態(tài)。所以細(xì)胞貼壁與否和細(xì)胞本身分泌細(xì)胞外基質(zhì)的能力以及細(xì)胞本身表達(dá)的黏附分子的數(shù)量有關(guān)，也與培養(yǎng)皿壁的表面結(jié)構(gòu)有關(guān)。

因此我們可以著手于這些促細(xì)胞附著物質(zhì)，對(duì)癥下藥。

膠原蛋白（Collagen）

是支持細(xì)胞和組織生長(zhǎng)的重要胞外基質(zhì)蛋白，其形成的胞外環(huán)境有利于多種細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、遷移和分化。膠原主要包括I型膠原，Ⅱ型膠原，Ⅲ型膠原，Ⅳ型膠原，Ⅴ型膠原，Ⅵ型膠原幾種。

I型膠原——最常見(jiàn)的膠原蛋白，促進(jìn)細(xì)胞的貼壁和增殖，用于內(nèi)皮細(xì)胞，肝細(xì)胞，肌細(xì)胞等的培養(yǎng)。

軟骨細(xì)胞對(duì)II型膠原的黏附性較好；上皮細(xì)胞在Ⅳ型膠原底物上貼壁良好，而在I、II、III型膠原底物的培養(yǎng)板上貼壁情況較差。

膠原應(yīng)用及建議細(xì)胞基質(zhì)濃度：

 

纖維粘連蛋白（Fibronectin，F(xiàn)N）

一種位于細(xì)胞表面和血漿中的大分子蛋白質(zhì)，是一種主要的細(xì)胞黏附分子，在細(xì)胞纖維基質(zhì)中發(fā)揮結(jié)構(gòu)和黏附性作用。

建議以1-5ug/cm²或者 0.5-50ug/ml的濃度作為細(xì)胞基質(zhì)，但最佳濃度取決于細(xì)胞類(lèi)型或研究目的、應(yīng)用方向。

BI也提供Fibronectin solution（貨號(hào): 03-090-1），可參考如下方法包被：

• 19ml無(wú)菌的PBS加1ml的纖連蛋白 (濃度50ug/ml)；

• 之后一個(gè)T25 (表面積25cm²)需用2.5ml包被, 所以視使用情形分裝包被；

• 一個(gè)T25加2.5ml纖維粘連蛋白溶液；

• 放4度至少30分鐘；

• 吸出纖維粘連蛋白溶液；

• 用無(wú)菌的PBS潤(rùn)洗一次, 即可培養(yǎng)細(xì)胞。
   

層粘連蛋白（Laminin）

是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成，存在于所有上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的基底側(cè)，同時(shí)也是某些細(xì)胞與細(xì)胞間交互作用的中間媒介。層粘連蛋白有細(xì)胞及組織特異性，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞功能具有重要作用，如：協(xié)助粘附、促進(jìn)生長(zhǎng)、引導(dǎo)遷移、調(diào)控分化、維持表型、防止細(xì)胞凋亡等。

在哺乳動(dòng)物胚胎中，Laminin 521和511是最早表達(dá)的胞外蛋白，在2-4細(xì)胞期，已經(jīng)可以檢測(cè)到。LN111支持hPSCs高效，符合GMP標(biāo)準(zhǔn)地分化為均一的多巴胺（DA）前體細(xì)胞。相比擬胚體（EB）為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)方案，DA前體細(xì)胞的產(chǎn)量在LN111上增加40倍以上。

層粘連蛋白，根據(jù)不同細(xì)胞系，包被濃度一般為5-20ug/ml。

BioLamina人類(lèi)重組層粘連蛋白：

化學(xué)成分限定，無(wú)異源動(dòng)物成分。

使用1×DPBS(Ca²⁺/Mg²⁺)稀釋?zhuān)�并將包被溶液加入到培養(yǎng)皿中，確保包被溶液覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿表面，2-8℃孵育過(guò)夜或37℃孵育2小時(shí)。
 

玻連蛋白（Vitronectin）

屬于小分子蛋白，借由Vitronectin 受體讓細(xì)胞貼附于細(xì)胞基質(zhì)中，主要促進(jìn)細(xì)胞遷移，增加細(xì)胞貼附性、細(xì)胞分裂、細(xì)胞生長(zhǎng)分化等，并協(xié)助細(xì)胞間的訊號(hào)傳遞。

MSC 促貼壁試劑→點(diǎn)擊查看產(chǎn)品信息

MSC促貼壁試劑是Biological Industries產(chǎn)品，搭配MSC NutriStem XF Medium使用，效果更佳。MSC促貼壁試劑針對(duì)多種來(lái)源的hMSC（骨髓，脂肪組織和臍帶）特別開(kāi)發(fā)。

特點(diǎn)：
• 無(wú)異源體系 
• 適用于多種來(lái)源的MSC細(xì)胞貼壁
• 即用型，100倍濃縮液
• 適用于無(wú)血清體系
• 適用hMSC增殖和誘導(dǎo)分化試劑

可參考如下包被方法：

1.使用DPBS溶液，將MSC貼壁試劑稀釋100倍（1:100）。

2.加入適量的1XMSC貼壁試劑涂層培養(yǎng)皿或板；包被期間， 注意包被液不可以干掉！

3.輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，確認(rèn)貼壁試劑均勻分布于培養(yǎng)皿表面后，用封口膜包裹涂層的培養(yǎng)皿。

4.在2-8℃孵育過(guò)夜；或者在CO₂培養(yǎng)箱，37℃，至少孵育30分鐘。

5.接種前, 吸除貼壁試劑，再用DPBS輕輕沖洗培養(yǎng)皿，即可接種細(xì)胞。

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