從不同動(dòng)物組織中提取總DNA的方法及步驟

1. 從動(dòng)物組織中提取總DNA
a．取不超過(guò)25mg的組織(脾不超過(guò)10mg)，剪切成盡可能小的碎片，加入180微升樣品裂解液A。
請(qǐng)勿使用過(guò)多的樣品，過(guò)多的樣品會(huì)導(dǎo)致抽提效果下降。較小的組織碎片會(huì)使裂解速度加快，裂解效果提高。新鮮或凍存的組織均可，但固定過(guò)的組織請(qǐng)參考后續(xù)的其它步驟進(jìn)行。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。裂解的時(shí)間因組織不同而有所不同，通常可在1-3小時(shí)內(nèi)完成。為方便起見(jiàn)，可以直接裂解過(guò)夜，裂解過(guò)夜對(duì)抽提效果無(wú)任何負(fù)面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應(yīng)該呈可把DNA純化柱堵住的凝膠狀。如果消化過(guò)夜仍呈凝膠狀，說(shuō)明樣品用量過(guò)多，作為補(bǔ)救措施，可以把整個(gè)反應(yīng)體系放大一倍。
c．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml       RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
轉(zhuǎn)錄活性水平很高的組織例如肝和腎組織，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步驟(步驟1.c)的情況下，會(huì)導(dǎo)致最后獲得的總DNA含有小部分RNA。如果殘余的少量RNA對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有干擾，可以不進(jìn)行本步實(shí)驗(yàn)操作，直接進(jìn)入步驟d。
d．最高速劇烈Vortex 15秒。加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后需立即Vortex混勻。加入樣品裂解液B后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，但大多數(shù)情況在70℃孵育后會(huì)溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。有些組織例如肺、脾，在加入樣品裂解液B后可能會(huì)形成凝膠狀物，此時(shí)需劇烈晃動(dòng)或Vortex樣品，以盡量破壞凝
膠狀物。
e．加入200微升無(wú)水乙醇，Vortex混勻。
加入乙醇后必須充分混勻，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果。加入乙醇后可能產(chǎn)生白色沉淀，屬正�，F(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉(zhuǎn)移到純化柱內(nèi)。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內(nèi)。≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到DNA純化柱內(nèi)，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時(shí)間延長(zhǎng)而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘�！�12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進(jìn)行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來(lái)的DNA量相對(duì)較少。如果對(duì)于獲得較多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復(fù)洗脫一次。第二次洗脫可以增加產(chǎn)量10-80%，特別是當(dāng)?shù)谝淮蜗疵撓聛?lái)的DNA大于10微克時(shí)，第二次洗脫可以獲得第一次洗脫時(shí)50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對(duì)洗脫效果的改善相對(duì)不太明顯。

2. 從鼠尾中抽提總DNA
a．取0.4-0.6cm的大鼠尾尖一段，或小鼠尾尖最多兩段，加入180微升樣品裂解液A。
小鼠尾尖最長(zhǎng)不能超過(guò)1.2cm，大鼠尾尖不能超過(guò)0.6cm。如果使用的是成年大鼠或小鼠，建議僅使用0.4-0.6cm長(zhǎng)的尾尖。如果抽提鼠尾的DNA用genotyping，使用0.2-0.3cm長(zhǎng)的尾尖已經(jīng)足夠。
b．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻，55℃水浴孵育至完全裂解。
在孵育期間可以偶爾取出樣品Vortex以加快裂解速度。并確保鼠尾浸沒(méi)在裂解液內(nèi)。裂解完全通常需6-8小時(shí)。為方便起見(jiàn)，可以直接裂解過(guò)夜，裂解過(guò)夜對(duì)抽提效果無(wú)任何負(fù)面影響。組織完全裂解后可以呈粘稠狀，但不應(yīng)該呈可把DNA純化柱堵住的凝膠狀。如果消化過(guò)夜仍呈凝膠狀，說(shuō)明樣品用量過(guò)多，作為補(bǔ)救措施，可以把整個(gè)反應(yīng)體系放大一倍。
c．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
鼠尾中RNA含量很低，但在不做清除RNA的操作步驟(步驟2.c)的情況下，會(huì)導(dǎo)致最后獲得的總DNA含有少量的RNA。如果殘余的少量RNA對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有干擾，可以不進(jìn)行本步實(shí)驗(yàn)操作，直接進(jìn)入步驟d。
d．按照等體積混合適當(dāng)體積的樣品裂解液B和無(wú)水乙醇，Vortex混勻。
每一個(gè)樣品，需混合200微升樣品裂解液B和200微升無(wú)水乙醇。如果有10個(gè)樣品，則需混合2ml樣品裂解液B和2ml無(wú)水乙醇，以此類(lèi)推。配制好的樣品裂解液B和無(wú)水乙醇的等體積混合液，室溫放置，3個(gè)月內(nèi)有效。必須Vortex充分混勻，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果。
e．最高速劇烈Vortex 15秒。加入400微升步驟d配制的樣品裂解液B和無(wú)水乙醇等體積混合液，劇烈Vortex混勻。
加入樣品裂解液B和無(wú)水乙醇的等體積混合液后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，屬正常現(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉(zhuǎn)移到純化柱內(nèi)，沉淀不會(huì)影響抽提效果。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內(nèi)。≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到DNA純化柱內(nèi)，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時(shí)間延長(zhǎng)而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘�！�12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進(jìn)行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來(lái)的DNA量相對(duì)較少。如果對(duì)于獲得較多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復(fù)洗脫一次。第二次洗脫可以增加產(chǎn)量10-80%，特別是當(dāng)?shù)谝淮蜗疵撓聛?lái)的DNA大于10微克時(shí)，第二次洗脫可以獲得第一次洗脫時(shí)50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對(duì)洗脫效果的改善相對(duì)不太明顯。

3. 從培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中抽提總DNA
a．收集最多不超過(guò)500萬(wàn)的細(xì)胞，離心沉淀后重懸于200微升PBS中。
PBS需自備。如果使用凍存的細(xì)胞沉淀，先把細(xì)胞沉淀解凍，并輕輕彈散，然后再加入PBS。對(duì)于基因組DNA含量較高的細(xì)胞，例如Hela細(xì)胞，應(yīng)使用較少的細(xì)胞，例如100-200萬(wàn)Hela細(xì)胞。
b．清除RNA(可選做)。如果希望獲得不含RNA的高純度總DNA，加入4微升100mg/ml RNase A，Vortex混勻。室溫(15-25℃)放置2分鐘。
在不做清除RNA的操作步驟(步驟3.b)的情況下，會(huì)導(dǎo)致最后獲得的總DNA含有小部分RNA。如果殘余的少量RNA對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)沒(méi)有干擾，可以不進(jìn)行本步實(shí)驗(yàn)操作，直接進(jìn)入步驟c。
c．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。
d．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
加入樣品裂解液B后必須立即Vortex混勻。不可把蛋白酶K直接和樣品裂解液B混合。
e．加入200微升無(wú)水乙醇，Vortex混勻。
加入乙醇后必須充分混勻，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果。加入乙醇后可能會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，屬正常現(xiàn)象，后續(xù)步驟中必須把白色沉淀和溶液全部轉(zhuǎn)移到純化柱內(nèi)。
f．把步驟e中的混合物加入到DNA純化柱內(nèi)�！�6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
注意：必須把沉淀全部轉(zhuǎn)移到DNA純化柱內(nèi)，否則會(huì)嚴(yán)重影響抽提效果！
g．加入500微升洗滌液I，≥6000g(約≥8000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
h．加入600微升洗滌液II，≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘。倒棄廢液收集管內(nèi)液體。
進(jìn)行本步驟前需將純化柱置于廢液收集管上。倒棄廢液后回收廢液收集管。
i．再≥18000g(約≥12000rpm)離心1分鐘，以去除殘留的乙醇。
不可把步驟h的離心時(shí)間延長(zhǎng)而省略本步驟。倒棄廢液后再離心可以確保充分去除殘留的乙醇。
j．將DNA純化柱置于一潔凈的1.5ml離心管上，加入50-200微升洗脫液。室溫放置1-3分鐘�！�12000rpm離心1分鐘。所得液體即為純化得到的總DNA。
洗脫液需要直接加至純化柱管內(nèi)柱面中央，使液體被純化柱吸收。如果有必要，可以使用去離子水或TE進(jìn)行洗脫。使用較小體積的洗脫液可以使獲得的總DNA的濃度較高，但洗脫下來(lái)的DNA量相對(duì)較少。如果對(duì)于獲得較多量的DNA非常重要，可以在第一次用200微升洗脫液洗脫后，再用200微升洗脫液重復(fù)洗脫一次。第二次洗脫可以增加產(chǎn)量10-80%，特別是當(dāng)?shù)谝淮蜗疵撓聛?lái)的DNA大于10微克時(shí)，第二次洗脫可以獲得第一次洗脫時(shí)50-80%的量。一次性加入多于200微升的洗脫液對(duì)洗脫效果的改善相對(duì)不太明顯。

4. 從動(dòng)物血液中抽提總DNA
本操作方法也適用于血沉棕黃層(buffy coat)和骨髓(bone marrow)的總DNA抽提。
a．取50-100微升紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核的血，或5-10微升活細(xì)胞有細(xì)胞核的血。
人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的紅細(xì)胞無(wú)細(xì)胞核，鳥(niǎo)、魚(yú)、蛙等的紅細(xì)胞有細(xì)胞核。紅細(xì)胞有細(xì)胞核會(huì)導(dǎo)致相同體積的血液內(nèi)DNA的含量非常高。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入PBS至總體積為220微升，Vortex混勻。
d．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。70℃孵育10分鐘。
e．轉(zhuǎn)步驟3.e。后續(xù)步驟同“從培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中抽提總DNA”3.e起的步驟。
5. 從石蠟包埋的組織樣品中抽提總DNA
由于包埋的組織通常已經(jīng)被固定，通常僅能獲得長(zhǎng)度小于650bp的DNA。乙醇或甲醛固定的石蠟包埋組織樣品相對(duì)比較適合DNA的抽提，而有交聯(lián)作用的固定試劑(例如鋨酸)固定的組織則不適合用于抽提DNA。需自備二甲苯。
a．取一塊小于25mg的包埋塊，加入1.2ml二甲苯，劇烈Vortex，以充分脫臘。
b．臺(tái)式離心機(jī)最高速(12000-14000rpm)室溫離心5分鐘，棄上清。
注意，去除上清的時(shí)候要非常小心，不要把沉淀丟失了。
c．加入1.2ml無(wú)水乙醇，輕輕Vortex混勻，以去除殘留的二甲苯。
d．臺(tái)式離心機(jī)最高速(12000-14000rpm)室溫離心5分鐘，棄上清。
注意，去除上清的時(shí)候要非常小心，不要把沉淀丟失了。
e．重復(fù)步驟c和d一次，即再用乙醇洗滌樣品一次。
f．棄上清后再最高速離心1分鐘，用20微升槍小心吸除殘留的液體。
g．室溫放置數(shù)分鐘至乙醇全部揮發(fā)。
h．加入180微升樣品裂解液A。
i．轉(zhuǎn)步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動(dòng)物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。

6. 從甲醛固定的組織中抽提總DNA
由于組織已經(jīng)被固定，通常僅能獲得長(zhǎng)度小于650bp的DNA。甲醛或乙醇固定的組織樣品相對(duì)比較適合DNA的抽提，而有交聯(lián)作用的固定試劑(例如鋨酸)固定的組織則不適合用于抽提DNA。乙醇固定的組織可以參考甲醛固定的組織的抽提方法進(jìn)行總DNA的抽提。
a．取不超過(guò)25mg的組織，用PBS洗滌兩次，以充分去除固定液。
b．去除PBS，轉(zhuǎn)步驟1.a，后續(xù)步驟同“從動(dòng)物組織中提取總DNA”1.a起的步驟。

7. 從革蘭氏陰性菌中抽提總DNA
a．離心收集最多不超過(guò)20億個(gè)細(xì)菌，棄上清。
b．加入180微升樣品裂解液A，充分重懸細(xì)菌。
c．轉(zhuǎn)步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動(dòng)物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。

8. 從革蘭氏陽(yáng)性菌中抽提總DNA
需自備溶菌酶，并配制溶菌酶溶液：20mM Tris，pH8.0，2mM EDTA，1.2% Triton X-100，20mg/ml溶菌酶。溶菌酶在臨使用前加入。
a．離心收集最多不超過(guò)20億個(gè)細(xì)菌，棄上清。
b．用180微升溶菌酶溶液充分重懸細(xì)菌。
c．37℃孵育30分鐘以裂解細(xì)菌。
d．加入20微升蛋白酶K，Vortex混勻。
e．加入200微升樣品裂解液B，Vortex混勻。
不可把蛋白酶K直接加入到樣品裂解液B中。
f．70℃孵育30分鐘。
g．轉(zhuǎn)步驟1.e，后續(xù)步驟同“從動(dòng)物組織中提取總DNA”1.e起的步驟。

9. 從酵母中抽提總DNA
需自備用于裂解酵母的酶lyticase，并配制酵母裂解液：1M 山梨糖醇(sorbitol)，100mM EDTA，14mM 2-巰基乙醇。
a．離心收集最多不超過(guò)50萬(wàn)個(gè)酵母，棄上清。
b．用600微升上述酵母裂解液重懸，加入200U lyticase，30℃孵育30分鐘。
注意：裂解的時(shí)間會(huì)隨酵母的種類(lèi)不同而有所不同，詳細(xì)情況請(qǐng)參考lyticase的說(shuō)明書(shū)。
c．300g離心10分鐘收集沉淀，棄上清。
d．沉淀用180微升樣品裂解液A重懸。
e．轉(zhuǎn)步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動(dòng)物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。

10. 從昆蟲(chóng)中抽提總DNA
a．用液氮冷凍后研碎處理：
a).取最多不超過(guò)50mg昆蟲(chóng)(例如果蠅)，液氮冷凍后研碎，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中。
b).加入180微升樣品裂解液A。
c).轉(zhuǎn)步驟1.b，后續(xù)步驟同“從動(dòng)物組織中提取總DNA”1.b起的步驟。
b．用勻漿器勻漿處理：
a).取最多不超過(guò)50mg昆蟲(chóng)(例如果蠅)。
b).加入180微升PBS，用電動(dòng)勻漿器或玻璃勻漿器勻漿。
c).轉(zhuǎn)步驟3.b，后續(xù)步驟同“從培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞中抽提總DNA”3.b起的步驟。

11. 從其它樣品中抽提總DNA
對(duì)于某些樣品需使用特定的裂解液裂解，可以參考如下方法進(jìn)行總DNA的抽提。
a．樣品用200微升特定的裂解液裂解。裂解需確保呈溶液狀態(tài)，如果有不溶物需通過(guò)離心沉淀去除。
b．加入20微升蛋白酶K。
c．加入200微升樣品裂解液B，立即Vortex混勻。
d．70℃孵育10分鐘。
檢查整個(gè)溶液的pH值，確保pH值小于7.0，否則DNA結(jié)合到純化柱的效率會(huì)很低。
e．轉(zhuǎn)步驟1.e，后續(xù)步驟同“從動(dòng)物組織中提取總DNA”1.e起的步驟。