質(zhì)粒大量抽提操作過程及技巧詳解

通常大腸桿菌宜用LB培養(yǎng)過夜(16小時(shí)左右)至OD值為2-4。建議5000g(通常為5000rpm左右)室溫離心1分鐘，如沉淀不充分則適當(dāng)延長離心時(shí)間。時(shí)間過長或離心速度過快會(huì)使沉淀過于緊密，不利于加入溶液I后散開沉淀。直接倒掉上清，再倒入約50毫升菌液并重復(fù)上述操作，然后倒置于吸水紙上(可用普通草紙)，使液體流盡。如果細(xì)菌密度明顯偏低，可考慮使用更多菌液，再重復(fù)上述操作1-2次。對于高拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過150毫升，對于低拷貝質(zhì)粒所用菌量每管一般不能超過200毫升。過量的細(xì)菌會(huì)導(dǎo)致后續(xù)的裂解不充分。

2. 每管加入5毫升溶液I，重懸細(xì)菌沉淀。確保沉淀完全散開，無可見細(xì)菌團(tuán)塊。
確認(rèn)溶液I中已添加了RNase A。最高速度vortex 10-20秒或更長時(shí)間，懸起沉淀。一定要充分混勻，對著光亮處觀察應(yīng)呈均勻的懸濁液，無明顯細(xì)菌團(tuán)塊或絮塊。如果沒有vortex，可以用槍吹打沉淀使沉淀逐漸散開，或手指把沉淀彈開。

3. 每管加入5毫升溶液II，輕輕顛倒離心管4-6次，室溫放置1-2分鐘，使細(xì)菌完全裂解，溶液透明。
切勿vortex！vortex或其它劇烈操作會(huì)導(dǎo)致基因組DNA斷裂，易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒被基因組DNA污染。顛倒4-6次后，溶液應(yīng)變得透明，無團(tuán)塊或絮狀物。如果加入溶液I后細(xì)菌沒有完全散開，那么顛倒4-6次后，可能還會(huì)有團(tuán)塊或絮狀物。遇到有少量團(tuán)塊或絮狀物產(chǎn)生的情況，可以增加顛倒次數(shù)3-5次，再室溫放置2-3分鐘，但總裂解時(shí)間不可超過5分鐘。

4. 每管加入7毫升溶液III，隨即顛倒離心管4-6次混勻，可見白色絮狀物產(chǎn)生。
切勿vortex！顛倒次數(shù)也不宜過多，否則易導(dǎo)致最終所得質(zhì)粒的質(zhì)量下降。

5. 12,000-14,000rpm)室溫離心10分鐘。
如果離心機(jī)的最高速度較低，需要適當(dāng)延長離心時(shí)間，例如約5000-6000rpm時(shí)需要離心20-30分鐘或更長時(shí)間，直至沉淀充分。離心時(shí)可以準(zhǔn)備好質(zhì)粒純化柱，自制漏斗等，并在純化柱上標(biāo)上記號。

6. 將上一步驟離心后的上清倒入或吸入到質(zhì)粒純化柱內(nèi)。12,000-14,000rpm離心2分鐘，倒棄收集管內(nèi)液體。
質(zhì)粒倒入質(zhì)粒純化柱后，可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。本步驟及后續(xù)需要12,000-14,000rpm離心2分鐘的步驟，如果離心機(jī)的最高速度較低，需要適當(dāng)延長離心時(shí)間，例如約5000-6000rpm時(shí)需要離心約5分鐘或更長時(shí)間，直至液體全部穿柱。如果離心后有少量漂浮物，可以考慮再次離心，或者使用擦鏡紙兩次對折后打開形成的自制漏斗，以過濾去除漂浮物。

7. 在質(zhì)粒純化柱內(nèi)加入12毫升溶液IV，12,000-14,000rpm離心2分鐘，洗去雜質(zhì)，倒棄收集管內(nèi)液體。
加入溶液IV后可以不用等待，直接離心。倒棄收集管內(nèi)的液體后，保留收集管繼續(xù)使用。

8. 12,000-14,000rpm再次離心2分鐘，除去殘留液體并使痕量乙醇完全揮發(fā)。
注意：倒棄收集管內(nèi)液體后再離心，才能徹底去除微量的溶液IV。微量的溶液IV會(huì)影響質(zhì)粒的質(zhì)量。

9. 將質(zhì)粒純化柱置于50毫升離心管上，加入2毫升溶液V至管內(nèi)柱面上，放置2分鐘。
也可以用重蒸水或MilliQ級純水替代溶液V，但是水的pH應(yīng)不小于6.5。溶液V加入后放置時(shí)間稍長，對于增加質(zhì)粒產(chǎn)量會(huì)略有幫助。如想得到較高濃度的質(zhì)粒，可以加入1毫升溶液V洗脫，質(zhì)粒得率實(shí)測減少約5-10%，具體減少量與特定樣品有關(guān)。

10. 12,000-14,000rpm離心2分鐘，所得液體即為轉(zhuǎn)細(xì)胞級超純質(zhì)粒。
通常所得質(zhì)粒濃度為0.1-0.3mg/ml左右，可以用于細(xì)胞轉(zhuǎn)染。如果想得到高濃度的質(zhì)粒，可以采用如下的異丙醇沉淀方法濃縮質(zhì)�；虺Ｒ�(guī)的乙醇沉淀方法。
a. 加入0.7倍體積的常溫異丙醇(例如1毫升待濃縮質(zhì)粒中加入0.7毫升異丙醇)，混勻后1,2000-14,000rpm 4℃離心10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。
如果希望獲得較高濃度的質(zhì)粒，在洗脫時(shí)推薦采用1毫升洗脫液進(jìn)行洗脫，后續(xù)可以轉(zhuǎn)移到2毫升離心管內(nèi)進(jìn)行異丙醇沉淀，這樣操作起來相對比較方便。異丙醇沉淀的DNA為玻璃狀近透明的顆粒狀沉淀，和乙醇沉淀產(chǎn)生的含鹽沉淀物相比較難觀察清楚。離心后取放離心管要盡量輕柔，避免沉淀松動(dòng)或部分顆粒狀懸浮至溶液中。不推薦直接倒棄上清，直接倒棄上清時(shí)經(jīng)常出現(xiàn)直接把質(zhì)粒沉淀倒掉的情況；如果偏好直接倒棄上清，建議把上清倒棄至一潔凈離心管內(nèi)，這樣萬一沉淀被倒出，仍然可以從潔凈離心管中回收。推薦用移液槍吸去上清，并注意盡量避免吸走沉淀。
b. 加入1毫升常溫70%乙醇溶液，輕輕懸起質(zhì)粒沉淀以充分洗滌，12,000-14,000rpm 4℃離心5-10分鐘，小心吸去上清液，避免觸及沉淀。
c. 5,000-10,000rpm 4℃離心5-10秒，用20微升或200微升移液器小心吸凈殘留液體，避免觸及沉淀。
d. 肉眼觀察無明顯液體后(吸凈液體后通常在1分鐘內(nèi)即可完成干燥)，加入適當(dāng)體積的溶液(如溶液V、10mM Tris-Cl pH8.5或Milli-Q級純水)溶解DNA。
DNA樣品不能過于干燥，否則很難溶解。最好在弱堿性條件下溶解DNA，溶解時(shí)可用緩沖液反復(fù)沖洗管壁，使管壁上的DNA充分溶解。

附表1. EndA^- and EndA⁺ strains of E. coli.