一步法TUNEL細胞凋亡檢測技巧及常見問題分析

a. PBS或HBSS洗滌一次。
b. 如果細胞貼得不牢，可以干燥樣品使細胞貼得更牢。
c. 用碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定細胞30分鐘。
d. 用PBS或HBSS洗滌一次。
e. 加入碧云天生產(chǎn)的免疫染色強力通透液或含0.3% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘。
f. 轉(zhuǎn)步驟5。

2. 對于懸浮細胞或細胞懸液：
a. 收集細胞(不超過200萬細胞)，PBS或HBSS洗滌一次。
b. 用碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定細胞30分鐘。為防止細胞聚集成團，宜在側擺搖床或水平搖床上緩慢搖動的同時進行固定。
c. 用PBS或HBSS洗滌一次。
d. 用碧云天生產(chǎn)的免疫染色強力通透液或含0.3% Triton X-100的PBS重懸細胞，室溫孵育5分鐘。
e. 轉(zhuǎn)步驟5。

3. 對于石蠟切片：
a. 二甲苯中脫蠟5-10分鐘。換用新鮮的二甲苯，再脫蠟5-10分鐘。無水乙醇5分鐘。90%乙醇2分鐘。70%乙醇2分鐘，蒸餾水2
分鐘。
b. 滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K(推薦使用碧云天的 蛋白酶K(20mg/ml)，用免疫染色洗滌液或10mM Tris-HCl pH7.4-7.8稀釋1000倍即為20μg/ml不含DNase的蛋白酶K)，20-37℃作用15-30分鐘(不同組織的最佳作用溫度和時間需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗滌3次。注意：這一步必須把蛋白酶K洗滌干凈，否則會嚴重干擾后續(xù)的標記反應。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。

4. 對于冰凍切片：
a. 用碧云天生產(chǎn)的免疫染色固定液或4%多聚甲醛固定細胞30-60分鐘。
b. PBS或HBSS洗滌2次，每次10分鐘。
c. 加入含碧云天生產(chǎn)的免疫染色強力通透液或含0.5% Triton X-100的PBS，室溫孵育5分鐘。
d. 轉(zhuǎn)步驟5。

5. 配制TUNEL檢測液：
參考下表配制適當量的TUNEL檢測液，需充分混勻。注意：配制好的TUNEL檢測液必須一次使用完畢，不能凍存。

6. 對于貼壁細胞、細胞涂片或組織切片：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 在樣品上加50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。注意：50μl TUNEL檢測液適合涂片、切片或96孔板、48孔板、24孔板或12孔板的一個孔，如果是6孔板中的一個孔TUNEL檢測液宜使用100μl。如果待檢測的樣品為涂片、切片或在24孔板、12孔板或6孔板中，可以使用防蒸發(fā)膜，或自行嘗試使用自封袋或者其它適當材料自行裁剪成比孔略小的圓形塑料片，滴加TUNEL檢測液后覆蓋在樣品上，可以防止TUNEL檢測液蒸發(fā)，并且使TUNEL檢測液均勻覆蓋樣品。自行裁剪圓片時需要連著圓片突出一個角或連著一條，并將圓形之外的突出部分折疊，方便染色結束后利用突出部分順利取出圓片。也可以用PAP Pen圈出一個區(qū)域進行染色。孵育時需注意在多余的孔和多孔板的空隙中加入適量水以保持濕潤，從而盡量減少TUNEL檢測液的蒸發(fā)
c. PBS或HBSS洗滌3次。
d. 用抗熒光淬滅封片液封片后熒光顯微鏡下觀察�？梢允褂玫募ぐl(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。染色效果可參見圖1。

7. 對于懸浮細胞或細胞懸液：
a. 用PBS或HBSS洗滌2次。
b. 加入50μl TUNEL檢測液，37℃避光孵育60分鐘。
c. PBS或HBSS洗滌2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS懸浮。
e. 此時可以用流式細胞儀進行檢測或涂片后在熒光顯微鏡下觀察。可以使用的激發(fā)波長范圍為450-500nm，發(fā)射波長范圍為515-565nm(綠色熒光)。

常見問題：
1. 出現(xiàn)非特異性熒光標記。
a. 有些細胞或組織，例如平滑肌細胞或組織，nuclease或polymerase的酶活性水平較高，易導致出現(xiàn)非特異性的熒光標記。解決方法是，取細胞或組織后立即固定并且要充分固定，以阻止這些酶導致假陽性。
b. 使用了不適當?shù)墓潭ㄒ�，例如一些酸性固定液，導致出現(xiàn)假陽性。建議采用推薦的固定液。
c. TUNEL檢測反應時間過長，或TUNEL檢測反應過程中反應液滲漏，細胞或組織表面不能保持濕潤，也可能出現(xiàn)非特異性熒光。注意控制反應時間，并確保TUNEL檢測反應液能很好地覆蓋樣品。
2. 熒光背景很高。
a. 支原體污染。請使用支原體染色檢測試劑盒檢測是否為支原體污染。支原體染色檢測試劑盒可以向碧云天訂購。
b. 高速分裂和增殖的細胞，有時也會出現(xiàn)細胞核中的DNA斷裂。
c. TUNEL反應過強�？梢杂迷噭┖刑峁┑腡dT酶稀釋液稀釋TdT酶2-5倍后再按照說明書操作。稀釋后的TdT酶需當日使用。
d. 紅細胞中血紅蛋白導致的自發(fā)熒光產(chǎn)生嚴重干擾。此時宜選擇其它細胞凋亡檢測試劑盒。
3. 標記效率低。
a. 使用乙醇或甲醇固定會導致標記的效率較低。
b. 固定時間過長，導致交聯(lián)程度過高。此時宜減少固定時間。
c. 熒光淬滅。熒光在普通光照10分鐘就會嚴重淬滅。解決方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶雙染時，如果碘化丙啶染色過深會導致觀察到的本試劑盒的TUNEL染色效果減弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激發(fā)產(chǎn)生的熒光，從而起到淬滅作用。解決方法是用較低濃度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。
e. 貼壁細胞如果使用藥物誘導凋亡，會使發(fā)生凋亡細胞的貼壁性會減弱，所以建議在凋亡誘導結束后，用可以對多孔板進行離心的離心機1000g離心5分鐘，然后再吸除培養(yǎng)基并用PBS洗滌。如果沒有適合的離心機，請注意操作輕緩，防止發(fā)生凋亡的細胞在洗滌時洗去。后續(xù)整個操作也需要輕緩。