微生物多樣性測序在證明腸道菌群移植可改善心房顫動（AF）的應(yīng)用

圖1 老年大鼠腸道菌群成功在受體大鼠中重新定植并促進AF易感性
 

3. 隨著年齡的增長，微生物來源的脂多糖增加，促進房顫

腸道菌群可以通過產(chǎn)生活性代謝物影響宿主生理活動，如TMAO、脂多糖、膽汁酸等。脂多糖水平（circulating LPS）隨著年齡的增長而增加，并在與年齡相關(guān)疾病的炎癥過程中起重要作用。因此推測脂多糖可能通過介老齡化過程中的心房炎癥而促進房顫。為了確定脂多糖在年齡相關(guān)性房顫中的作用，作者收集了1152名人類獻(xiàn)血者的血漿樣本進行脂多糖水平檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著年齡的增長，血漿脂多糖濃度逐漸升高。此外，在老年組和aged-FMT組大鼠中也發(fā)現(xiàn)了脂多糖水平的增加，表明脂多糖可能介導(dǎo)與老年相關(guān)的房顫的炎癥反應(yīng)。

脂多糖主要通過激活TLR4蛋白的表達(dá)而導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子的分泌，該蛋白在老年大鼠心房組織中的表達(dá)高于其他器官，老年人心房更易受脂多糖的影響。LPS-RS是一種有效的脂多糖拮抗劑，用于aged-FMT組大鼠后(1毫克/千克，每周一次，持續(xù)6周)，作者發(fā)現(xiàn)aged-FMT組大鼠房顫誘發(fā)率和房顫持續(xù)時間顯著降低；心房纖維化和纖維化相關(guān)蛋白的表達(dá)水平也通過脂多糖-受體顯著改善，證明老年微生物群通過升高的循環(huán)脂多糖促進對房顫的易感性。

圖2 老齡化過程中循環(huán)LPS水平的增加促進AF易感性
 

 

4. 老齡化菌群移植導(dǎo)致腸道屏障功能障礙

脂多糖是由大多數(shù)革蘭氏陰性菌的外膜囊泡產(chǎn)生的。然而，在aged-FMT組和young-FMT組之間的糞便中沒有發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性細(xì)菌豐度和脂多糖水平的差異，可能是腸道屏障的功能障礙導(dǎo)致這一結(jié)果。因此，作者研究了老年菌群移植是否改變腸道屏障的完整性。結(jié)果，近端結(jié)腸的HE 和 Masson染色顯示aged-FMT組大鼠絨毛長度較短，纖維化面積增加。作者用口服異硫氰酸熒光素(FITC)-葡聚糖測試腸滲透性，發(fā)現(xiàn)aged-FMT組大鼠的血清FITC葡聚糖水平明顯高于young-FMT組大鼠。

為了揭示在觀察到的腸道表型中微生物群-上皮細(xì)胞相互作用的潛在機制，作者對近端結(jié)腸組織樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)進行了深入分析。與aged-FMT組相比，共有179種蛋白(124種上調(diào)，55種下調(diào))在young-FMT組的近端結(jié)腸組織樣本中顯著異常表達(dá)(FC> 2.0，P < 0.05)。

火山圖中顯示了差異表達(dá)蛋白質(zhì)的概況。差異表達(dá)蛋白的具體數(shù)量如圖3F所示。KEGG通路分析表明，這些差異表達(dá)蛋白在33條途徑中富集，主要參與炎癥相關(guān)途徑。然后，作者進一步檢測了富集分析途徑的代表性蛋白的表達(dá)水平，包括aged-FMT組和young-FMT組大鼠近端結(jié)腸組織的ISG15、S100A8和S100A9，在老年糖尿病大鼠和人類老年志愿者中，炎癥相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)水平顯著增加。炎癥過程與循環(huán)脂多糖升高有關(guān)，可能參與了腸通透性增加，并且這種增加功能可以通過老年相關(guān)微生物移植來轉(zhuǎn)移。

圖3 老年組菌群移植導(dǎo)致腸道屏障功能障礙和病理變化
 

 

5. 老齡化相關(guān)脂多糖通過激活心房NLRP 3-炎癥小體促進房顫

脂多糖誘導(dǎo)的TLR4激活被認(rèn)為是介導(dǎo)NLRP 3-炎癥小體（參與多種年齡相關(guān)疾病的發(fā)生）表達(dá)的啟動信號。本研究中，雖然凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)的蛋白表達(dá)水平保持不變，但aged-FMT組大鼠心房中NLRP3、促半胱天冬酶-1和活化半胱天冬酶-1的水平顯著增加。并且aged-FMT組大鼠的NLRP 3-炎癥小體成分上調(diào)，同時TLR4/pNFjB通路的激活增強，pNFjB增加。白細(xì)胞介素(IL)-1b也因老年組的菌群移植而顯著增加。表明NLRP3——炎癥體的“啟動”和“組裝”都被老年組的菌群移植激活。

為了驗證NLRP 3-炎癥小體對老年相關(guān)微生態(tài)失調(diào)誘導(dǎo)的房顫的刺激作用，作者給aged-FMT組大鼠服用選擇性炎癥體抑制劑MCC950，以中斷NLRP 3-炎癥體復(fù)合物的組裝。MCC950顯著降低aged-FMT組大鼠心房NLRP3通路的表達(dá)水平。一系列實驗數(shù)據(jù)表明，老年微生物群通過circulating LPS誘導(dǎo)NLRP3升高，最終增強心房纖維化而導(dǎo)致房顫。

圖4 老年腸道菌群失調(diào)通過激活NLRP3通路促進AF易感性
 

 

6. 葡萄糖過量增強NLRP 3-炎癥小體活性

NLRP3炎癥小體可以被激活以響應(yīng)結(jié)構(gòu)多樣的損傷相關(guān)分子模式，作者推測葡萄糖可能參與了與老齡化相關(guān)的AF的發(fā)展。結(jié)果表明老年大鼠的OGTT明顯高于年輕大鼠，并且可通過FMT轉(zhuǎn)移，可推測老年微生物群失調(diào)導(dǎo)致葡萄糖耐量受損。體外實驗中用原代大鼠心肌細(xì)胞（CMs）和心臟成纖維細(xì)胞（CFs）模擬老年房顫患者的病理內(nèi)部環(huán)境。無論是LPS或HG（高糖處理）都不能單獨激活CFs中的NLRP 3-炎癥小體。CMs中LPS和HG對NLRP3炎癥小體的表達(dá)沒有影響。生理條件下，CF中TLR4的表達(dá)水平明顯高于CMs。LPS和HG也增加了CFs中纖維化蛋白的表達(dá)水平。通過免疫共沉淀檢測MCC950對CFs中NLRP3炎性小體活性的抑制作用。雖然NLRP3-ASC復(fù)合物的共定位不受影響，但NLRP3-Casp1-p20復(fù)合物的組裝被MCC950完全阻斷。

綜上所述，高糖是脂多糖激活心房NLRP 3-炎癥小體所必需的，并且CF中的TLR4易引發(fā)LPS或HG，這可以解釋隨著年齡的增長心房纖維化增強。

圖5 LPS和高糖增強NLRP3-炎性小體的激活
 

 

7. 長期健康年輕微生物群移植預(yù)防老年大鼠房顫

鑒于過量葡萄糖是脂多糖以TLR4方式增強CFs中NLRP 3-炎癥小體活性所必需的，作者隨后通過使用健康的年輕微生物群對老齡大鼠進行6個月的干預(yù)，評估了體內(nèi)微生物群再定植對老齡相關(guān)性房顫的潛在治療效果。

首先，HE染色觀察到移植年輕大鼠糞便的老年大鼠(aged+young-FMT)在近端結(jié)腸中的絨毛長度比有自體糞便移植的老年大鼠(aged+aged-FMT)長。Masson染色說明在aged+young-FMT大鼠中也觀察到近端結(jié)腸纖維化面積減少。然后，作者發(fā)現(xiàn)移植年輕大鼠菌群的大鼠的血漿LPS升高和糖耐量受損有恢復(fù)趨勢。并且發(fā)現(xiàn)young-FMT心房NLRP 3-炎癥小體的激活顯著降低，心房纖維化和TGF-b1和α-平滑肌肌動蛋白的表達(dá)水平也因年輕菌群移植而減弱。此外，在被年輕菌群重新定植的老年大鼠未能成功誘導(dǎo)房顫，這表明長期年輕的FMT可通過抑制心房NLRP3-炎癥小體的活性來預(yù)防年齡相關(guān)性房顫的發(fā)生。

圖6 年輕組菌群移植通過抑制nlrp3炎癥小體信號通路防止AF易感性，恢復(fù)腸道屏障功能障礙
 

 

8. 老年臨床患者體內(nèi)微生物代謝物和心房的病理變化

臨床數(shù)據(jù)方面，測量了從有房顫病史的老年患者(65歲以上)心房樣本中NLRP3、ASC、前胱天蛋白酶-1和活化胱天蛋白酶-1的蛋白水平。老年人和老年房顫患者心房中NLRP3炎癥體的表達(dá)水平顯著升高，而老年房顫患者的表達(dá)水平更高，表明NLRP 3-炎癥體的老年特異性表型與年齡相關(guān)性房顫的發(fā)病機制有關(guān)。在中年人群中，房顫的患病率隨著脂多糖水平的升高而呈上升趨勢，而在年輕人群中則沒有。

12012名合格臨床個體的OGTT結(jié)果中，隨著年齡的增長，男性和女性的HG水平都在上升，男性高于女性，這與房顫發(fā)病率的性別差異一致。此外，老年人類患者的絨毛較短，結(jié)腸組織過度纖維化。臨床數(shù)據(jù)進一步驗證了腸道菌群在老年房顫中的作用，并為針對腸道微生物在老年心血管疾病中的治療策略提供了更多的證據(jù)。

圖7 臨床個體心房及循環(huán)LPS、葡萄糖的病理改變
 

4.總結(jié)

心房顫動（簡稱房顫）是最常見的持續(xù)性心律失常。隨著年齡增長，房顫的發(fā)生率和死亡率不斷增加，而且由于其潛在機制的復(fù)雜性和并發(fā)癥的多樣性，房顫的復(fù)發(fā)率仍然很高。

本研究思路非常嚴(yán)謹(jǐn)，結(jié)果表明老齡化腸道菌群失調(diào)導(dǎo)致腸道屏障功能障礙、循環(huán)脂多糖異常升高、葡萄糖耐量受損和心房NLRP 3-炎癥小體活性增強，導(dǎo)致房顫易感性增加。并且這種菌群失調(diào)引起的促房顫效應(yīng)是可逆的（通過長期年輕大鼠菌群移植后促房顫特征消失）。

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