實(shí)時(shí)顯示腫瘤：可用于近紅外二區(qū)成像和術(shù)中腫瘤切除的高靈敏度探針

現(xiàn)如今盡管已經(jīng)開(kāi)發(fā)出幾種治療前列腺癌的藥物，根治性前列腺切除術(shù)仍然是最有效的治療方法和早期患者的首選，但是前列腺癌(PCa)由于其復(fù)雜的解剖結(jié)構(gòu)，在保留癌旁組織的同時(shí)對(duì)腫瘤進(jìn)行精確切除是一個(gè)挑戰(zhàn)。前列腺特異性膜抗原(prostate -specific membrane antigen, PSMA)是原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性前列腺腫瘤細(xì)胞膜上過(guò)表達(dá)的一種II型跨膜糖蛋白，PSMA的表達(dá)水平與前列腺癌分期和Gleason評(píng)分呈正相關(guān)，因此，PSMA可作為一種評(píng)估PCa（前列腺癌）的有效生物標(biāo)志物。近年來(lái)已經(jīng)開(kāi)發(fā)出了一些針對(duì)前列腺特異性膜抗原（PSMA）進(jìn)行光學(xué)成像的探針，如CY7-3、CY7-2和L16(圖1a)，它們?cè)诹姿猁}緩沖液(PBS)中的發(fā)射最大波長(zhǎng)分別為767、767和800 nm，這些探針存在著近紅外一區(qū)（NIR-I）探針固有的缺點(diǎn)，例如穿透組織能力差，分辨率有限。近紅外二區(qū) (NIR-II，1000-1700 nm)成像自體熒光水平較低，光子散射小，穿透能力強(qiáng)、具有高時(shí)空分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)，可以顯著提高成像質(zhì)量，可用于腫瘤切除術(shù)中導(dǎo)航。

作者在本文中設(shè)計(jì)、合成了一種帶有兩個(gè)前列腺特異性膜抗原(PSMA)結(jié)合基元的探針(PSMA-1092)，該探針具有優(yōu)異的光學(xué)性能(λmax= 1092 nm)，對(duì)PSMA具有超高親和力(Ki= 80 pM)。采用PSMA-1092探針進(jìn)行小鼠NIR-II成像，可以高分辨率顯現(xiàn)腫瘤(TNR= 7.62±1.05)，邊緣清晰，然后，作者將PSMA-1092用于小鼠前列腺腫瘤切除術(shù)中導(dǎo)航，在腫瘤切除過(guò)程中，NIR-II成像可對(duì)肉眼檢查遺漏的殘余腫瘤進(jìn)行實(shí)時(shí)成像檢測(cè)。總的來(lái)說(shuō)，PSMA-1092在描繪腫瘤邊緣和檢測(cè)殘余腫瘤方面表現(xiàn)良好，在臨床實(shí)踐中顯示了精確切除PCa腫瘤的潛力。

圖1：(a)以前報(bào)告的PSMA熒光探針的結(jié)構(gòu)。藍(lán)色表示結(jié)合基序，紫色表示NIR-I區(qū)的熒光團(tuán)。(b)新設(shè)計(jì)的NIR-II PSMA探針的結(jié)構(gòu)。
 

考慮到供體-受體-供體(D−A−D)核心結(jié)構(gòu)以及合適的電子受體和電子供體部分是獲得NIR-II近紅外二區(qū)熒光探針的關(guān)鍵因素，作者選擇苯二聯(lián)體(1,2,5-噻二唑)部分作為優(yōu)良的電子受體，共軛二甲基苯胺作為電子供體。以?xún)蓚�(gè)((S)5-氨基-1-羧基)氨基甲酰)- l -谷氨酸(Glu-urea-Lys)作為與PSMA特異性結(jié)合的基團(tuán)，通過(guò)酰胺鍵與熒光團(tuán)部分結(jié)合，增強(qiáng)了探針與PSMA的親和力(圖1b)，此外，Glu-urea-Lys基團(tuán)上的三個(gè)羧基也使探針具有較強(qiáng)的親水性，顯著提高了探針在水溶液中的溶解度，PSMA-1092探針的合成路線如下（方案1）。

方案1：試劑和條件:(a)丙烯酸、乙酸(20% in H2O)，100℃，隔夜，94.5%; (b)叔丁醇、DCC、DMAP、CH2Cl2，室溫，隔夜，43.2%;(c)六丁基二錫烷, Pd(PPh3)4，甲苯，N2, 120℃, 2 h;(d) 4,7-二溴-5,6-二硝基苯并[c][1,2,5]噻二唑，PdCl2(PPh3)2，甲苯，N2, 120℃,2 h, 7.7%;（e）鐵粉，醋酸，100℃，30分鐘，36.2%;(f) PhNSO, TMSCl，干吡啶，80°C，過(guò)夜，27.2%;(g) TFA, CH2Cl2，室溫，4 h, 100%;(h) 2,3,5,6-四氟苯酚，DCC, CH2Cl2，室溫，5 h, 67.4%;(i)二叔丁基(((S)-6-氨基-1-(叔丁基)-1-氧己基-2-基)氨基甲酰)- l –谷氨酸，Et3N, CH2Cl2，室溫，6 h, 61.3%。
 

PSMA-1092探針由于D-A-D結(jié)構(gòu)中強(qiáng)烈的分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)，其熒光發(fā)射峰在1092 nm處測(cè)得(DMSO，圖2a，b)，該峰位于近紅外二區(qū)，為了驗(yàn)證PSMA-1092的光穩(wěn)定性，將其二甲基亞砜溶液暴露于激光(727nm，10W)進(jìn)行30分鐘的連續(xù)輻射，沒(méi)有觀察到明顯的光降解(圖2c)，表明其出色的光穩(wěn)定性。在PBS中測(cè)得PSMA-1092的量子產(chǎn)率為6.66%，這對(duì)于近紅外二區(qū)成像來(lái)說(shuō)是足夠高的。利用近紅外成像系統(tǒng)，在不同的濾光片下進(jìn)一步比較了PSMA-1092在PBS中的近紅外熒光信號(hào)。PSMA-1092溶液在1000和1200nm LP濾光片下可見(jiàn)，而在1300或1400納米濾光片下未檢測(cè)到信號(hào)(圖2d)�？紤]到在1000nmLP濾光片下的熒光信號(hào)比其他濾光片更強(qiáng)，選擇1000nmLP濾光片用于進(jìn)一步的體內(nèi)近紅外二區(qū)成像。總的來(lái)說(shuō)，該探針具有良好的熒光發(fā)射波長(zhǎng)、較大的Stokes位移和優(yōu)異的光穩(wěn)定性，在體內(nèi)NIR-II近紅外二區(qū)成像方面具有很大的潛力。

圖2：(a) PSMA-1092的光學(xué)特性。在DMSO中最大吸收(λex1)和發(fā)射(λem1)波長(zhǎng)。PBS中測(cè)量的量子產(chǎn)量。在酸性水溶液(pH = 2.66)中測(cè)定吸收光譜(λex2)和發(fā)射光譜(λem2)。Ki（受體親和力指數(shù)）通過(guò)LNCaP細(xì)胞（人前列腺癌細(xì)胞）裂解液的抑制實(shí)驗(yàn)測(cè)定。Pka（結(jié)合常數(shù)）是根據(jù)Boltzmann曲線計(jì)算的。(b) PSMA-1092 (10 μM)在DMSO中的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。(c) PSMA-1092 (10 μM)在727 nm連續(xù)激光照射DMSO中的光穩(wěn)定性。(d) PSMA-1092 (0.43 mM)在PBS中與各種LP濾光片的NIR-II成像。白色虛線勾畫(huà)出了不可見(jiàn)的溶液。
 

此外，作者觀察到PSMA-1092的熒光性質(zhì)在不同pH值的溶液中發(fā)生了顯著變化(圖3a,b)，肉眼可以觀察到PSMA-1092溶液暴露在酸性溶液中，在自然光下由青色變?yōu)榱练凵?圖3c)，在365 nm紫外光下(圖3d)或在NIR-I成像中(圖3e)可以觀察到熒光逐漸增加。熒光光譜顯示，熒光極大值從1092 nm藍(lán)移至620 nm,且隨著溶液酸度的增加，620nm處的熒光強(qiáng)度隨著溶液酸度的增加而大大提高(圖3a,b)，當(dāng)溶液pH從7變到0.3時(shí)，PSMA-1092溶液的熒光強(qiáng)度增加了85倍。此外，PSMA-1092在620 nm處的熒光強(qiáng)度圖與pH值的Boltzmann曲線擬合良好(R2= 0.9984)，計(jì)算得到pKa為1.95(圖3b)。PSMA-1092的pH響應(yīng)突出了其在更廣泛領(lǐng)域的應(yīng)用潛力，比如在非侵入性測(cè)量胃液pH值時(shí)，從NIR-II區(qū)域到NIR-I區(qū)域的巨大波長(zhǎng)位移可以有效地避免原始波長(zhǎng)的影響，從而提高了檢測(cè)精度，進(jìn)一步的pH響應(yīng)應(yīng)用作者仍在研究當(dāng)中。

圖3 (a)PSMA-1092在不同pH值水溶液中的紫外-可見(jiàn)-近紅外吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。
 (b) 620 nm處的熒光(0.1 mM)信號(hào)強(qiáng)度與PSMA-1092在0−7.5范圍內(nèi)的pH值之間的曲線。根據(jù)Boltzmann擬合方法計(jì)算得到pKa為1.95，測(cè)量得到R2為0.9984。
 (c,d)不同pH值的PSMA -1092溶液在自然光(c)和365紫外光(d)下的照片。
 (e)上述溶液的NIR-I成像。
 (f) PSMA-1092在酸性環(huán)境中可能的質(zhì)子化機(jī)制。
 (g)在1.5 mL DMSO-d6中加入不同量氘化TFA的PSMA-1092的1H NMR譜(600 MHz, DMSO-d6)。箭頭表示帶有位移的峰值。
 

為了進(jìn)一步測(cè)試PSMA-1092的體內(nèi)性能，我們使用皮下LNCaP（人前列腺癌細(xì)胞）荷瘤小鼠(n = 3)進(jìn)行NIR-II成像。尾靜脈注射PSMA-1092（劑量為2.5毫克/千克體重），在不同的時(shí)間點(diǎn)(1、2、4、6、8、12、24 h,圖4) （792nm激光激發(fā)，100 mW / cm2 功率密度 ）(1000 nmLP濾光片,50 ms曝光時(shí)間)進(jìn)行NIR-II成像。如圖4所示，PSMA -1092在注射后2小時(shí)內(nèi)在腫瘤及周?chē)�組織中積累(圖4c)。注射后4小時(shí)，腫瘤與周?chē)�組織區(qū)別開(kāi)來(lái)，具有良好的對(duì)比度(圖4d)，并且在隨后的時(shí)間點(diǎn)保持了高質(zhì)量圖像 (圖4e-h)，這表明成像性能優(yōu)異且在小鼠模型中具有高穩(wěn)定性。為了獲得更詳細(xì)的藥代動(dòng)力學(xué)信息，進(jìn)行了基于近紅外圖像的腫瘤與正常組織比率(TNR)的半定量分析。由于PSMA-1092在正常組織中的清除速率快于在腫瘤中的清除速率，因此在注射后6小時(shí)達(dá)到最大腫瘤攝取量，而在注射后12小時(shí)獲得TNR峰值(7.62±1.05，圖4j)。根據(jù)勞斯判據(jù)，至少需要5的TNR才能100%區(qū)分圖像特征。在近紅外二區(qū)成像中，PSMA-1092的TNR值在注射后8小時(shí)達(dá)到5.99±0.72，并在隨后的時(shí)間點(diǎn)保持高水平(注射后12小時(shí)為7.62±1.05，注射后24小時(shí)為6.66±1.48，圖4j)，TNR值始終高于勞斯判據(jù)，可實(shí)現(xiàn)高質(zhì)量的近紅外二區(qū)成像。為了驗(yàn)證PSMA-1092對(duì)PSMA的特異性，我們進(jìn)一步對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行了阻斷實(shí)驗(yàn)(每組n=3)。聯(lián)合注射2-PMPA(一種強(qiáng)效和選擇性的谷氨酸羧肽酶II抑制劑，IC50=300 pM，34.3 mg/kg體重)和PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重)后于選定時(shí)間點(diǎn)獲得NIR-II圖像(792 nm激光激發(fā)，1000 nm LP濾光片，50 ms曝光時(shí)間)。只注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重)的荷瘤小鼠作為對(duì)照，如圖4k所示，在阻斷組中，活體小鼠的大部分腫瘤信號(hào)可被2-PMPA抑制，半定量分析表明，注射后6 h，對(duì)照組的TNR值遠(yuǎn)高于阻斷組(圖4m)，進(jìn)一步的離體成像顯示，聯(lián)合注射2-PMPA和PSMA1092后，來(lái)自腫瘤和腎臟的熒光信號(hào)被成功降低(圖4l)。這些結(jié)果很好地證明了PSMA-1092是PSMA的特異性配體，具有超高的親和力，滿(mǎn)足了NIR-II探針的成像需求。

圖4 (a−h)尾靜脈注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg)后不同時(shí)間點(diǎn)LNCaP荷瘤小鼠(n = 3)的NIR-II圖像。
 (i)PSMA-1092在主要器官生物分布的半定量分析。
 (j)荷瘤小鼠靜脈注射PSMA-1092后TNR(左Y軸，黑線)和腫瘤攝取(右軸，藍(lán)線)與時(shí)間曲線。
 (k) LNCaP荷瘤小鼠(n = 3)在不同時(shí)間點(diǎn)注射PSMA-1092（注射和不注射2-PMPA）后的NIR-II圖像。
 (l)兩組小鼠PSMA -1092生物分布定量分析。
 (m)兩組小鼠尾靜脈注射藥物后TNR -時(shí)間曲線。
 

為了驗(yàn)證PSMA-1092在腫瘤切除手術(shù)中進(jìn)行精確熒光圖像導(dǎo)航的可行性，作者選擇活體LNCaP（人前列腺癌細(xì)胞）荷瘤小鼠在麻醉下進(jìn)行腫瘤切除試驗(yàn)。根據(jù)上述影像數(shù)據(jù)，選擇在尾靜脈注射PSMA-1092 (2.5 mg/kg體重) 24 h后作為手術(shù)的最佳時(shí)間窗，以獲得最低背景信號(hào)。在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中，小鼠以0.4 L/ min的速度被異氟醚和氧氣聯(lián)合氣體麻醉，在NIR-II近紅外二區(qū)導(dǎo)航下切除腫瘤，整個(gè)過(guò)程由顯像儀記錄。首先，解剖腫瘤區(qū)域周?chē)�皮膚，暴露腫瘤(圖5b,c)。半定量分析顯示，切除覆蓋皮膚后，TNR值增加(從7.95增加到9.81，圖5n)。然后切除腫瘤(圖5d,f,g)，肉眼檢查認(rèn)為腫瘤已完全切除。但周邊仍可見(jiàn)強(qiáng)烈的熒光信號(hào)(圖5i)， TNR值為5.48(圖5n)，提示手術(shù)邊緣仍有遺漏的殘余腫瘤。在NIR-II熒光成像引導(dǎo)下，進(jìn)一步切除殘余腫瘤(圖5j)，同時(shí)盡可能保持健康組織，切除后TNR值降至3.12(圖5n)。但擴(kuò)大切除后，剩余組織中仍能檢測(cè)到熒光信號(hào)(圖5j)。進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)漏診的微小腫瘤(圖5k,l，紅色箭頭所示)，再進(jìn)一步切除腫瘤，影像學(xué)檢查未見(jiàn)殘留熒光信號(hào)(TNR = 2.97，圖5m,n)。蘇木精和伊紅(H&E)染色的組織學(xué)研究表明，切除的腫瘤是低分化癌�？偟膩�(lái)說(shuō)，PSMA-1092探針具有出色的腫瘤描繪能力，在腫瘤切除術(shù)中導(dǎo)航方面具有臨床轉(zhuǎn)化潛力。

圖5：(a−d,f,g,i−m)術(shù)中NIR-II成像引導(dǎo)下腫瘤精確切除圖像。(e,h)兩個(gè)切除腫瘤的組織學(xué)研究。(n)沿手術(shù)方向TNR值。

 

參考文獻(xiàn)

Zhang Longfei et al. Visualizing Tumors in Real Time: A Highly Sensitive PSMA Probe for NIR-II Imaging and Intraoperative Tumor Resection.[J]. Journal of medicinal chemistry, 2021

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