單細(xì)胞多組學(xué)技術(shù)在研究黑色素瘤細(xì)胞系的耐藥軌跡的應(yīng)用

文章題目：Multi-omic single-cell snapshots reveal multiple independent trajectories to drug tolerance in a melanoma cell line

發(fā)表期刊：綜合性一區(qū)期刊Nat Communications（IF=12.121）

發(fā)表時間：2020-05-11

 

1.研究背景

單細(xì)胞代謝組學(xué)/蛋白質(zhì)組學(xué)能直觀反映細(xì)胞動態(tài)功能的變化，是揭示細(xì)胞響應(yīng)化學(xué)和環(huán)境應(yīng)激的重要途徑。在高維細(xì)胞狀態(tài)空間中確定單個細(xì)胞的軌跡，對于理解從細(xì)胞分化到藥物作用下病變細(xì)胞的表觀遺傳反應(yīng)等生物學(xué)變化是一個突出的挑戰(zhàn)。

本文利用單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和單細(xì)胞代謝組學(xué)技術(shù)揭示了黑色素瘤細(xì)胞早期在藥物反應(yīng)和藥物耐受兩種狀態(tài)之間變化的軌跡，并發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在兩種狀態(tài)之間存在兩條完全不同的途徑。該結(jié)果對于腫瘤耐藥性的研究提供了新的認(rèn)識。

 

2.實驗設(shè)計



3.分析結(jié)果

 

1. BRAFi處理后黑色素瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析

作者對細(xì)胞樣本進(jìn)行了0、1、3和5天（0為對照組，1、3、5為實驗組）的藥物治療。與對照組相比，藥物處理組中，黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子(MITF, MART1)，代謝調(diào)節(jié)因子(HIF1α, p-AMPKα)，擴(kuò)增標(biāo)記(Ki67)等在單細(xì)胞水平的表達(dá)存在明顯差異（圖1 b、c）。具體來看，在藥物治療初期，葡萄糖的攝取、多數(shù)代謝調(diào)節(jié)因子、磷酸化蛋白、Ki67被抑制，這些物質(zhì)的抑制反應(yīng)了BRAFi對關(guān)鍵致癌信號通路的抑制作用。

圖1 早期藥物處理后M397細(xì)胞的單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析

 

2. 降維分析單細(xì)胞水平從藥物敏感狀態(tài)到耐藥狀態(tài)的路徑變化

對經(jīng)過BRAFi不同時長處理的樣本，利用FLOW-MAP算法對復(fù)雜高維的單細(xì)胞數(shù)據(jù)降維處理，來可視化眾多物質(zhì)在單細(xì)胞水平的變化。圖2中顯示不同時長處理的黑色素瘤細(xì)胞呈現(xiàn)出不同模式的聚集，且MITF、MART1、Ki67、NGFR等蛋白的表達(dá)水平在第0天和第1天/3天到第5天耐藥性上呈現(xiàn)出了向上和向下的分叉軌跡，也暗示從藥物敏感狀態(tài)到藥物耐受狀態(tài)存在兩條通路的可能性。

 

3. Surprisal揭示細(xì)胞時間軌跡中的不同聚集模塊

為了進(jìn)一步解析藥物耐藥性的分子變化軌跡，作者利用Surprisal分析了單細(xì)胞數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)了兩個主要模塊（每個模塊代表一組被檢測物質(zhì)）。單細(xì)胞中模塊的影響分?jǐn)?shù)表示模塊中關(guān)聯(lián)分析物質(zhì)在該細(xì)胞中富集或抑制的程度（圖3 a）。文章中發(fā)現(xiàn)模塊1的影響分?jǐn)?shù)在上下兩條路徑上都從負(fù)逐漸增加到正，并且在中間時間點有明顯的正負(fù)變化（圖3 a）。模塊2的影響分?jǐn)?shù)也有同樣的變化模式，兩個聚集模塊的分隔說明在耐藥發(fā)展過程中可能存在一個生物物理屏障將上下路徑分隔開了。

圖3 可視化展示兩個主要模塊的影響分?jǐn)?shù)

此外，黑色素瘤細(xì)胞表型轉(zhuǎn)錄因子MITF及其下游蛋白MART1的表達(dá)均與模塊2評分呈負(fù)相關(guān)（圖3 b），這表明兩條路徑的分岔可能與這兩種蛋白有密切關(guān)系。

 

4. 路徑分岔的實驗驗證

Surprisal分析預(yù)測了從藥物敏感狀態(tài)到耐受狀態(tài)存在上下兩個路徑。但是單細(xì)胞是沿著單個軌跡進(jìn)行兩種狀態(tài)的轉(zhuǎn)換還是會隨機(jī)地在多個路徑之間切換？文章中實驗結(jié)果顯示，MITF-高表達(dá)細(xì)胞顯示出較高水平的Ki67和MITF豐度，并且與MITF-低表達(dá)亞群相比，有更短的擴(kuò)增時間（圖4 c-f）。

圖4 surprisal分析表明MITF為調(diào)節(jié)路徑分岔的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子

為了量化藥物治療期間MITF-高表達(dá)和MITF-低表達(dá)細(xì)胞之間隨機(jī)相互轉(zhuǎn)化的頻率，作者在BRAFi治療的第5天內(nèi)檢測了單細(xì)胞內(nèi)的MITF活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MITF-高表達(dá)細(xì)胞中的MITF活性顯示出比MITF-低表達(dá)細(xì)胞更高的活性（圖5 g），沒有觀察到兩個軌跡之間進(jìn)行明顯的隨機(jī)切換。

圖5 對BRAFi治療5天的細(xì)胞用單細(xì)胞延時顯微鏡分析MITF 活性

為了進(jìn)一步確認(rèn)在治療的第5天后，不同類群的細(xì)胞狀態(tài)，作者量化了治療第5天后上下通路之間差異表達(dá)的SLUG、MITF、MART1和PFK在內(nèi)的多個被檢測物。結(jié)果顯示，SLUG、MITF、MART1和PFK在兩條路徑之間出現(xiàn)了明顯的差異表達(dá)（圖4 h）。此外，SLUG、MITF、MART1和PFK在MITF-低表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于MITF-高表達(dá)細(xì)胞（圖4 i）。

 

5. 臨界點分析確定了軌跡分岔調(diào)節(jié)物質(zhì)

作者對單細(xì)胞數(shù)據(jù)集的Surprisal分析結(jié)果表明，在治療的第1天到第3天中，上下通路都具有細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)換的特征。

圖6 兩條軌跡的臨界點分析和網(wǎng)絡(luò)分析

為了識別上下兩條通路上的每個臨界點，作者將所有時間點的單細(xì)胞數(shù)據(jù)聚集成14個細(xì)胞類群（圖6 a）。每一個類群代表一個過渡的中間狀態(tài)，類群1、6、7、8、10、11和12位于上通路，2、3、9、13和14位于下通路。利用SANI和Ic來預(yù)測高維狀態(tài)下的臨界轉(zhuǎn)變情況，作者發(fā)現(xiàn)上通路中細(xì)胞類群7和細(xì)胞類群9在各自路徑中有最高SANI值（圖6 b、c）。這表明細(xì)胞類群7和細(xì)胞類群9最接近這2條路徑上的臨界點。

通過對細(xì)胞類群7和細(xì)胞類群9的臨界點進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析，發(fā)現(xiàn)這兩個集群的網(wǎng)絡(luò)具有不同的結(jié)構(gòu)特征（圖6 d、e），表明這兩個細(xì)胞類群以不同的方式調(diào)節(jié)細(xì)胞群的轉(zhuǎn)變。網(wǎng)絡(luò)中的hub節(jié)點調(diào)節(jié)物質(zhì)，可能是潛在的藥物靶點。在細(xì)胞類群7（上通路），作者發(fā)現(xiàn)了一些轉(zhuǎn)錄因子和代謝酶，如MITF、PFK、p-LKB、PKM2、LDH2和SLUG，在網(wǎng)絡(luò)中顯示出較高的連接（圖6 f）。對于細(xì)胞類群9（下通路），TNFR、N-cadherin和p-NFκB-p65在網(wǎng)絡(luò)中表現(xiàn)出高連接性（圖6 f）。另外，在細(xì)胞類群7中得分高的物質(zhì)在細(xì)胞類群9中得分低，反之亦然，這表明這兩條路徑受到不同的調(diào)節(jié)。

 

6. 確定干擾兩條路徑的物質(zhì)

為了檢驗兩條路徑上的改變是否由不同的調(diào)節(jié)物質(zhì)驅(qū)動，作者選擇了PKM2抑制劑，NFκB抑制劑來分別干擾細(xì)胞類群7和細(xì)胞類群9，并聯(lián)合BRAFi治療分選的MITF-高表達(dá)細(xì)胞和MITF-低表達(dá)細(xì)胞亞群。結(jié)果顯示，MITF-低表達(dá)細(xì)胞亞群對BRAFi+NF-κBi組合更敏感（圖7 a），而MITF-高表達(dá)細(xì)胞亞群對BRAFi+PKM2i組合更敏感（圖7 b）。在敲除MITF基因的M398細(xì)胞系上進(jìn)行相同藥物組合的檢測，結(jié)果也得到了同樣的結(jié)論（圖7 c、d）。說明，沿著不同軌跡的細(xì)胞對PKM2和NF-κB的抑制表現(xiàn)出不同的敏感性。

圖7 與兩條軌跡相關(guān)的細(xì)胞中藥物敏感性差異
 

考慮到這兩條軌跡的調(diào)節(jié)依賴性差異，作者進(jìn)一步假設(shè)，通過同時抑制PKM2和NF-κB信號傳導(dǎo)來共同阻斷這兩條軌跡，可能在阻止向BRAFi耐受的轉(zhuǎn)變方面表現(xiàn)出相加效應(yīng)。為了驗證這一假設(shè)，作者使用三種藥物組合（BRAFi+PKM2i+NF-κBi）在體外治療M397細(xì)胞5天，并將得到的細(xì)胞數(shù)與單藥（僅BRAFi）和雙藥組合（BRAFi+PKM2i和BRAFi+NF-κBi）治療5天的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行比較。與作者的預(yù)測一致，三種藥物組合明顯優(yōu)于兩種藥物組合，而兩種藥物組合又優(yōu)于單一療法（圖5 e）。這意味著這些藥物可能通過選擇性地阻斷BRAFi誘導(dǎo)的細(xì)胞狀態(tài)向藥物耐受狀態(tài)的轉(zhuǎn)變而發(fā)揮作用。這些結(jié)果表明，上下通路是獨立的，具有不同的調(diào)節(jié)物質(zhì)，有各自對應(yīng)的藥物可以阻斷通路。

 

4.研究結(jié)論

該研究通過單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)揭示了黑色素瘤細(xì)胞藥物耐藥性形成的反應(yīng)軌跡，為確定有效的治療組合提供了更準(zhǔn)確的指導(dǎo)。

 

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