轉(zhuǎn)錄因子ERG調(diào)節(jié)微血管系統(tǒng)中低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的抗血栓途徑

止血是一種生理機(jī)制，旨在通過在受傷后形成血凝塊來維持血管完整性。一個(gè)健康內(nèi)皮細(xì)胞的重要功能是通過對(duì)許多促凝和抗凝基因的精細(xì)調(diào)控來維持一個(gè)基本的抗血栓狀態(tài)。在由內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 控制的多種促凝和抗凝途徑中，血栓調(diào)節(jié)蛋白 (TM) 是調(diào)節(jié)凝血和血栓形成的關(guān)鍵參與者。根據(jù)其抗凝和抗炎作用，TM與多種炎癥和缺血性病理有關(guān)，如靜脈血栓栓塞、出血性疾病、冠狀動(dòng)脈疾病和動(dòng)脈粥樣硬化等。

先前的研究表明，不同的外部刺激能夠轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié) TM。層流剪切應(yīng)力 (SS) 已被證明上調(diào) TM 表達(dá)，而炎癥細(xì)胞因子如 TNF-α 通過轉(zhuǎn)錄因子 (TF) NF-κB 抑制 TM 表達(dá)。多個(gè) TF 參與了TM表達(dá)的調(diào)控，包括 Krüppel 樣因子 2 (KLF2)。KLF2 已被證明可以在靜態(tài)、低SS 和高SS 條件下調(diào)節(jié) EC 中的 TM 水平。由KLF2介導(dǎo)的高SS上調(diào)TM表達(dá)，這是大動(dòng)脈中重要的保護(hù)性抗血栓和抗動(dòng)脈粥樣硬化的機(jī)制。

然而，與內(nèi)皮細(xì)胞TM的缺失不同，小鼠體內(nèi) KLF2 的缺失導(dǎo)致 TM 表達(dá)的適度降低，并不足以引起自發(fā)性血栓形成，這表明 KLF2 需要與其他 TF 合作來調(diào)節(jié) TM 水平并發(fā)揮其抗血栓作用，可能是在選定的血管床上。

TF ETS-related gene (ERG) 是成人分化EC中E-26轉(zhuǎn)化特異性(ETS)家族中最豐富的成員，在所有血管床中都有表達(dá)。多項(xiàng)研究已經(jīng)描述了 ERG 在內(nèi)皮中的重要作用，比如調(diào)節(jié)血管發(fā)育和血管生成、促進(jìn)血管穩(wěn)態(tài)、抑制健康內(nèi)皮細(xì)胞中的血管炎癥等。

基于此，來自英國帝國理工學(xué)院國家心肺研究所、美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)系等領(lǐng)域的研究團(tuán)隊(duì)在 Nature Communications 上發(fā)表了題為《The transcription factor ERG regulates a low shear stress-induced anti-thrombotic pathway in the microvasculature》的文章。鑒于ERG的多重穩(wěn)態(tài)功能，該實(shí)驗(yàn)假設(shè)ERG可能在EC中具有抗血栓作用，從而保護(hù)血管免受自發(fā)性血栓的形成。
 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：
 

首先，為了研究ERG發(fā)揮其抗血栓作用的分子機(jī)制，實(shí)驗(yàn)使用了可誘導(dǎo)內(nèi)皮缺失ERG (Erg ^iEC-KO )的成年小鼠。最后數(shù)據(jù)表明，在選定的血管床中，內(nèi)皮TF ERG是防止自發(fā)性血栓形成的關(guān)鍵。ERG的缺失破壞了凝血的調(diào)節(jié)，導(dǎo)致肝和肺中與血栓和/或出血相關(guān)的凝血病。

其次，為了研究 ERG 發(fā)揮其抗血栓功能的分子機(jī)制，分析了 ERG 缺失的 HUVEC 的全局轉(zhuǎn)錄組譜，并確定了多個(gè)直接或間接參與凝血調(diào)節(jié)的基因作為ERG 的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)。這些基因在 HUVEC 中進(jìn)行了 qPCR 驗(yàn)證。最后發(fā)現(xiàn)表明， ERG 可能以組織特異性的方式調(diào)節(jié)多種促凝和抗凝基因，并指出 TM 是 ERG 抗血栓作用的關(guān)鍵候選基因。

然后，為了測試在Erg ^iEC-KO 小鼠中觀察到的血栓表型是否是由于TM 表達(dá)的減少，實(shí)驗(yàn)使用了靶向紅細(xì)胞 (RBC-TM) 的小鼠重組 TM 融合蛋白來恢復(fù)體內(nèi) TM 蛋白的活性。最后數(shù)據(jù)表明，用 RBC-TM 進(jìn)行急性治療能夠顯著挽救在Erg ^iEC-KO小鼠中觀察到的凝血功能障礙。

接下來，實(shí)驗(yàn)使用體外模型來研究 ERG 控制 TM 表達(dá)的機(jī)制。通過免疫印跡（圖1 b、c，圖2 b ) 和IF顯微鏡(圖1 d、e )檢測，與對(duì)照組siRNA相比，siRNA處理12、24 和 48h 抑制了HUVEC中 ERG表達(dá)，可導(dǎo)致TM mRNA（圖1 a和圖2 a）和蛋白表達(dá)下降。

ERG 還在人真皮微血管 EC（HDMEC）（圖1 d和圖2 d）和人真皮血液EC（HDBEC）（圖1 e）中調(diào)節(jié)微血管 EC 中 mRNA 和蛋白質(zhì)水平的 TM 表達(dá) 。相反，ERG 過表達(dá)（圖2 e、f）顯著增加了 HUVEC 中的TM表達(dá)（圖1 f）。

TM 是凝血酶介導(dǎo)的天然抗凝劑 APC 5激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑。為了研究 ERG 對(duì) TM 表達(dá)的調(diào)控是否導(dǎo)致其功能的調(diào)控，實(shí)驗(yàn)對(duì)用 ERG siRNA 處理的 HUVEC 進(jìn)行了蛋白 C 激活測定，并測量了APC 隨時(shí)間的產(chǎn)生。與降低的 TM 表達(dá)一致，ERG 缺失細(xì)胞（圖2 g，h）在與蛋白 C 孵育 30 分鐘后顯示出APC 的產(chǎn)生減少，與 siCtrl 細(xì)胞相比，在60 min時(shí)間點(diǎn)APC的生成減少最大(圖1 g)。

這些結(jié)果表明 ERG 調(diào)節(jié) TM 水平，從而調(diào)節(jié) EC 中的 TM-蛋白 C 系統(tǒng)。

圖 1

圖 2

在體外，實(shí)驗(yàn)證明 ERG 與TM啟動(dòng)子結(jié)合并轉(zhuǎn)化，并確定了一個(gè)ERG-KLF2 復(fù)合物，它協(xié)同驅(qū)動(dòng)TM的表達(dá)；ERG 促進(jìn) KLF2 染色質(zhì)進(jìn)入、DNA 結(jié)合和TM 啟動(dòng)子的反式激活。

盡管在體外靜態(tài)條件下，KLF2和TM在EC中表達(dá)，但它們是重要的血流響應(yīng)基因:層流剪切應(yīng)力(SS)上調(diào)KLF2的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)TM的表達(dá)增加。但是，ERG是否是一個(gè)血流響應(yīng)型TF尚不清楚。

接下來，實(shí)驗(yàn)首先研究了低(5 dynes per cm²)和高(20 dynes per cm²)層流SS對(duì)HUVEC中ERG和KLF2蛋白水平的影響。正如預(yù)期的那樣，與靜態(tài)條件相比，暴露于低 SS和高 SS 的 HUVEC 中 KLF2 蛋白水平上調(diào)，相反，ERG 蛋白水平不受 SS 的影響（圖3 a）。與靜態(tài)條件相比，在低 SS 條件下 ERG-KLF2 復(fù)合物的形成增加，高 SS 沒有進(jìn)一步增加這種相互作用（圖3 b）。

然后研究了 ERG 在使用 ERG 或?qū)φ?siRNA 處理的 HUVEC中，在靜態(tài)、低SS 、高 SS 條件下，在調(diào)節(jié)TM 表達(dá)中的作用。正如預(yù)期的那樣，與靜態(tài)條件相比，暴露于 SS 的 HUVEC 中KLF2和TM mRNA 水平上調(diào)，而ERG mRNA 水平不受影響（圖3 c）。

重要的是，雖然高SS誘導(dǎo)了在ERG缺失細(xì)胞中TM表達(dá)的上調(diào)，但低SS無法誘導(dǎo)其上調(diào)（圖3 c），表明ERG在低 SS 條件下選擇性地控制TM的表達(dá)，并且它對(duì)于高SS依賴性的TM調(diào)控是不可缺少的。

這些結(jié)果表明，ERG 和 KLF2 之間的合作對(duì)于 TM 在低 SS 條件下的表達(dá)是必不可少的，并表明其在高SS條件下，有其他基因/通路支持KLF2依賴性轉(zhuǎn)錄。

HUVEC 是體外使用最廣泛的 EC 模型，但不能概括來自不同血管床的 EC 的所有特性。因此，為了研究 ERG 在微血管或動(dòng)脈來源的 EC 中 TM 的調(diào)節(jié)作用，實(shí)驗(yàn)還對(duì)人微血管 EC（HDBEC）（圖3 d）和人主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞（HAEC）進(jìn)行了流動(dòng)實(shí)驗(yàn)。與 HUVEC 相比，HDBEC 實(shí)驗(yàn)顯示出相似的結(jié)果，表明ERG在低SS條件下特異性調(diào)節(jié)TM的表達(dá)，在微血管EC中也是如此（圖3 d）。

圖 3

最后，實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，ERG 在暴露于低 SS 的微血管床中特異性調(diào)節(jié) TM的 表達(dá)，但在暴露于高SS 的血管（主動(dòng)脈）EC 中則不然。
 

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
 

總之，研究表明 ERG 對(duì)于維持內(nèi)皮抗血栓環(huán)境至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)證明 ERG 是 TM 的直接轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過與 KLF2 合作以特定的方式驅(qū)動(dòng)其表達(dá)。

鑒于血栓性疾病對(duì)特定器官的血管床表現(xiàn)出選擇性偏好，血管床特異性通路的識(shí)別對(duì)人類病理具有潛在的重要意義。該途徑可能參與與微血管血栓形成和/或凝血病相關(guān)的人類疾病的發(fā)病機(jī)制，例如彌散性血管內(nèi)凝血、溶血性尿毒癥綜合征或敗血癥。


參考文獻(xiàn)：

Peghaire C, Dufton NP, Lang M, Salles-Crawley II, Ahnström J, Kalna V, Raimondi C, Pericleous C, Inuabasi L, Kiseleva R, Muzykantov VR, Mason JC, Birdsey GM, Randi AM. The transcription factor ERG regulates a low shear stress-induced anti-thrombotic pathway in the microvasculature. Nat Commun. 2019 Nov 1;10(1):5014. doi: 10.1038/s41467-019-12897-w. PMID: 31676784; PMCID: PMC6825134.

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