單細(xì)胞測(cè)序在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

上周我們分享了《從單個(gè)細(xì)胞入手的腫瘤研究》，這周我們接著聊聊從單細(xì)胞入手怎樣幫助解析黑色素瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療不良事件的發(fā)生機(jī)制，并發(fā)現(xiàn)潛在治療靶點(diǎn)。



腫瘤免疫治療是目前該領(lǐng)域最具前景的發(fā)展方向之一。隨著PD-(L)1、CTLA-4等免疫檢查點(diǎn)抑制劑應(yīng)用范圍逐漸擴(kuò)大，對(duì)復(fù)發(fā)、難治性腫瘤患者表現(xiàn)出了突破性療效，給更多腫瘤患者帶來(lái)希望。然而近60%的PD-(L)1、CTLA-4聯(lián)合治療患者出現(xiàn)嚴(yán)重的毒性反應(yīng)等不良事件。腸道炎癥 (checkpoint inhibitor induced colitis，+CPI colitis)是最常見(jiàn)的不良事件，也是停止治療的重要原因。我們目前對(duì)其發(fā)生及發(fā)展的機(jī)制仍不清楚，如果能夠找到應(yīng)對(duì)的方法將會(huì)大大提高免疫檢查點(diǎn)抑制劑的受益群體。

這篇發(fā)表在《cell》上題為“Molecular Pathways of Colon Inflammation Induced by Cancer Immunotherapy”的文章是如何開(kāi)展相關(guān)研究的呢？

文章對(duì)黑色素瘤免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療引發(fā)腸道炎癥組、治療無(wú)不良事件對(duì)照組、正常對(duì)照組對(duì)照的腸穿刺樣本（n = 6 +CPI colitis, n = 5 +CPI no colitis, n = 5 control），解離單細(xì)胞懸液后分別分選CD45⁺（白細(xì)胞）和CD3⁺(T細(xì)胞）免疫細(xì)胞，進(jìn)行5’轉(zhuǎn)錄組+免疫組庫(kù)單細(xì)胞測(cè)序（圖1），通過(guò)單細(xì)胞數(shù)據(jù)的分析交出了完美的答卷。

圖1：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思路圖

CD45⁺抗體分選后進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，+CPI colitis組中非常顯著的T細(xì)胞和髓系細(xì)胞富集，而Control組和+CPI no colitis組具有較高的相似性，這表明T細(xì)胞群體的這些變化與疾病狀態(tài)相關(guān)，而不是藥物治療。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)對(duì)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

圖2：CD45⁺T細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序亞群分析

接下來(lái)對(duì)CD3⁺抗體分選細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，更精準(zhǔn)地分析，CD8⁺T細(xì)胞組成在+CPI colitis組與兩個(gè)對(duì)照組之間有顯著差異，具有高度細(xì)胞毒性和增殖狀態(tài)的CD8⁺T細(xì)胞大量堆積。并用流式細(xì)胞分析及多色免疫熒光在不同層面進(jìn)行了驗(yàn)證。同樣對(duì)CD4⁺T細(xì)胞群體也進(jìn)行了分析，+CPI colitis組與兩個(gè)對(duì)照組相比，同樣存在特異性大量富集的細(xì)胞亞群。調(diào)節(jié)T細(xì)胞（regulatory T cells，Treg）是一群具有負(fù)調(diào)控免疫反應(yīng)的淋巴細(xì)胞，之前有研究在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，抗CTLA-4免疫治療能夠?qū)е耇reg細(xì)胞的耗竭，據(jù)此推論免疫治療不良事件的產(chǎn)生可能與Treg細(xì)胞的耗竭有關(guān)。而本研究在對(duì)CD4⁺T細(xì)胞的分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxP3+ Treg細(xì)胞比例和FoxP蛋白表達(dá)量在+CPI colitis樣本中均有顯著提升。Treg細(xì)胞亞群分析也識(shí)別出了+CPI colitis特異性的具有Th1細(xì)胞活性的Treg細(xì)胞亞群。這表明免疫檢查點(diǎn)抑制劑引起的腸道炎癥不是由Treg細(xì)胞耗竭導(dǎo)致的，炎性微環(huán)境影響了Treg細(xì)胞的表達(dá)譜。進(jìn)一步對(duì)腸道炎癥相關(guān)T細(xì)胞和髓系細(xì)胞中特異表達(dá)基因進(jìn)行了分析，INFr和TNFa應(yīng)答基因顯著富集。

圖3：CD8⁺T細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序亞群分析及流式、多色免疫熒光驗(yàn)證

圖4：CD4⁺T細(xì)胞單細(xì)胞測(cè)序亞群分析及流式

進(jìn)一步對(duì)CD8⁺T細(xì)胞不同亞群的TCR克隆擴(kuò)增進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)+CPI colitis組與兩個(gè)對(duì)照組之間也存在顯著差異，腸道炎癥相關(guān)CD8⁺T細(xì)胞有很大一部分來(lái)自于組織駐留記憶T細(xì)胞。
 

圖5：CD8⁺T細(xì)胞單細(xì)胞免疫組庫(kù)測(cè)序克隆擴(kuò)增分析

通過(guò)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及免疫組庫(kù)數(shù)據(jù)揭示了腸道炎癥這一不良事件的分子發(fā)生機(jī)制，那么我們據(jù)此再找到潛在治療靶點(diǎn)就完美了。

通過(guò)對(duì)前面得到的數(shù)據(jù)分析揭示趨化因子受體抑制劑、aEb7 、 a4b7整合抑制劑、TNFa阻斷劑、IL-1b阻斷劑等均提示具有改善腸道炎癥的潛力。如趨化因子受體基因CXCR6在+CPI colitis組的T細(xì)胞中高表達(dá)，被IFN和TNF信號(hào)通路調(diào)控的CXCR6配體基因CXCL16在髓系細(xì)胞和肥大細(xì)胞中也同樣高表達(dá)。并且CXCR6在多種人類(lèi)腫瘤細(xì)胞中都高表達(dá)，故以CXCR6作為潛在的治療靶點(diǎn)，或可有效改善腸道炎癥。

圖6：T細(xì)胞-髓系細(xì)胞的連接及治療靶標(biāo)分析

文章首次通過(guò)單細(xì)胞視角對(duì)免疫治療誘導(dǎo)腸炎組和免疫治療、正常人兩組對(duì)照的腸穿刺樣本，分別分選免疫細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞測(cè)序，揭示了免疫治療誘導(dǎo)腸炎的分子發(fā)生機(jī)制，具有高度細(xì)胞毒性和增殖狀態(tài)的CD8⁺T細(xì)胞的大量堆積，且沒(méi)有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞耗竭的證據(jù)。TCR序列分析發(fā)現(xiàn)腸炎相關(guān)CD8⁺T細(xì)胞有很大一部分來(lái)自于組織駐留記憶T細(xì)胞，這解釋了免疫治療開(kāi)始后腸炎一般較早發(fā)作。對(duì)細(xì)胞因子，趨化因子，表面受體的分析發(fā)現(xiàn)他們可以作為免疫檢查點(diǎn)阻斷引起腸炎的治療靶標(biāo)。